単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

このナノ構造チップベースのプラットフォームの全体的な目標は、膜タンパク質の機能を単一分子レベルで高度に並行して解析することです。単一のタンパク質を分離する能力により、膜輸送とフラックスに関する新たな洞察が達成されます。この方法は、膜タンパク質分野における重要な問題、例えば単一チャネルやトランスポーターの伝導性や輸送挙動、特に非電気発生性の貨物などの質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、ナノ構造チップ設計から導き出された高い並列性であり、数十万のナノポアと輸送イベントの蛍光読み取りを特徴としています。この技術の意味するところは、膜タンパク質の効果的なライブラリーの最適なアッセイを作成するものにまで及びます。チップベースのプラットフォームにより、高度に並列化された自動輸送記録が可能になるためです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、提示された手法の処理方法をすぐに学びます。常に焦点は、関心のあるすべての人がそれを採用できるように、ユーザーフレンドリーなアッセイを作成することでした。この膜輸送アッセイは、反応イオンエッチングを使用して設計された絶縁ウェーハ上のシリコンを利用します。

各ウェーハから約 1, 000 個のアッセイチップが製造されます。各チップには 250 、 000 個のマイクロキャビティが含まれています。これらの空洞は、目的の輸送タンパク質を含む脂質二重層によって密封されます。

メンブレンはセンサーインターフェースを構成します。最初に、蛍光物質は脂質二重層の片側に含まれており、これはそれらが構成されるリポソームの内部に対応します。各キャビティは、マルチスペクトル蛍光読み出しを介してアドレス指定可能です。

不透明な最上層がバッファーリザーバーからの蛍光シグナルをブロックし、バイオチップを倒立蛍光顕微鏡と互換性を持たせます。原子間力顕微鏡を用いて、均一に配置された二酸化ケイ素層の細孔開口部と表面粗さを3.6ナノメートルで測定し、小胞融合に最適とした。走査型電子顕微鏡は、シリコンチップ内のフェムトリットル空洞にアクセスするナノポアを通る断面を示します。

このビデオでは、プロテオリポソームの調製、アッセイ用のチップの調製、および基本的なアッセイの実行を示しています。エタノール洗浄した丸底フラスコをロータリーエバポレーターに接続します。脂質膜を300ミリバール、摂氏30度の水浴温度、最大回転速度で40分間乾燥させ、フラスコのガラス壁に均質な脂質膜を形成します。

その後、高真空ポンプを用いて、脂質フィルムを室温でさらに30分間乾燥させます。次に、5ミリリットルの緩衝液と8つのエタノール洗浄ガラスビーズをフラスコに加えて、マルチラメラ小胞を作ります。フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、最高速度で摂氏50度で真空なしで回転します。

45分後、溶液は乳白色に見え、壁に脂質膜が残っていません。フラスコを不活性ガス下で超音波浴に移し、室温で4分間超音波処理します。超音波処理はリポソームを破壊し、それらを単層化します。

次に、LUV溶液を1ミリリットルのアリコートに分割し、液体窒素と摂氏40度の水浴を使用して5回の凍結融解サイクルを実行します。これにより、リポソームが破裂し、再配列し、成長します。最後の凍結ステップで、すべてのサンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

LUVアリコートを再構成する前に、ミニエクストルーダーを使用して、アリコートを400ナノメートルのポリカーボネートフィルターメンブレンに17回通してリポソームを押し出します。次に、0.25%in溶液に対して4%Triton X-100を添加してLUVを不安定化させます。混合物を摂氏50度で5分間インキュベートします。

次に、精製および改変されたMscLを界面活性剤飽和リポソームの20部に混合し、30分間インキュベーションを続けます。インキュベーション後、100マイクロリットルのアリコートを取り、30ミリモルの焼成物を1容量加えます。この混合物を摂氏50度で5分間インキュベートします。

次に、か焼処理されたサンプルと未処理のサンプルから洗剤を取り除きます。トリスバッファーに湿ったバイオビーズをそれぞれに加え、回転プレート上で摂氏4度で一晩インキュベートします。実験の前に、活性アッセイを用いて調製物を試験してください。

まず、エラストマーベースを硬化剤に混合し、混合物を完全に乾燥させて驚かせます。接着剤は、準備ができたら30分以内に使用する必要があります。その間、予防策を講じて、ガラス注射器から塗布された5ミリリットルのクロロホルムを使用してカバーガラススライドを洗浄し、スライドを乾かします。

次に、10マイクロリットルのピペットを使用して、準備した接着剤をカバーガラスに堆積させます。次に、細いピンセットを使用してウェーハボードからチップを慎重に取り除きます。チップのコーティング面を上にして、接着剤の上に堆積させ、スライドにそっとこすりつけて接着剤を均一に分散させます。

気泡が下に閉じ込められたり、接着剤がチップの上に付着したりしないようにしてください。また、8チャンバーのスライドホルダーに収まるように組み立てます。次に、アセンブリをキャビネット乾燥機で摂氏65度で2時間乾燥させます。

その後、摂氏54度で数回の溶剤洗浄でチップの保護層を取り除きます。まず、取り付けられたチップをスライドホルダーに入れます。次に、それらを3つの溶媒浴でそれぞれ10分間インキュベートします。

イソプロパノール、アセトン、およびイソプロパノール。次に、超純水でチップを丁寧によく洗います。窒素ガスの穏やかな流れの下でチップを乾燥させることにより、プロセスを完了します。

次に、8ウェルの粘着性スライドを準備し、ベンチに後ろ向きに置きます。次に、チップをウェルに向けて、カバースライドを慎重に持ち上げて粘着性のあるスライドに押し付けます。先に進む前に、アセンブリを数分間休ませます。

転座アッセイを進める前に、テキストプロトコールに記載されているように、チップアセンブリを十分に洗浄し、トリスバッファーバスで仕上げます。次に、浴液を5ミリモルの塩化カルシウムと1マイクロモルのOy647色素を含むDOPEd Tris緩衝液と交換します。次に、チップチャンバーにプロテオリポソームを添加して、最終濃度を1ミリグラム/ミリリットルにし、1時間待ちます。

1時間後、400マイクロリットルのカルシウムフリーTrisバッファーでチップを4回すすぎます。次に、制御された色素を各ウェルの5マイクロモルに添加し、アッセイを進めます。次に、チップホルダーを落射蛍光顕微鏡に取り付け、ナノポアチップの縁に焦点を合わせて微小共振器を見つけます。

マイクロキャビティにピントが合ったら、ナノポアアレイをスキャンして、天井比が最も高い領域を探します。詳細はテキストプロトコルで提供されます。リポソームを調製し、そのサイズ分布と分散性を確認しました。

調製したリポソームは、アッセイの細孔径よりも大きかったため、これは必須です。単分散リポソームもまた望ましい。実験の前に、リポソーム調製物中の修飾MscLタンパク質を蛍光消光アッセイを用いてチェックしました。

活性修飾MscLを保有するリポソームの比率は、転座実験を進めるのに十分でした。バイオチップ上では、修飾されたMscLチャネルを介した蛍光ターゲットの溶質転座が観察されました。化学変調器であるMTSETは、静電反発によって設計されたMscLチャネルを開くために使用されました。

その後のキャビティ空間内の蛍光の減少をモニターした。このプロセスは再現性が高く、非常に一貫した排出イベントが見られることが証明されました。結果として得られる流出曲線は、単一チャネルまたはマルチチャネルの転座イベントに対応する2つの異なる集団にクラスター化されました。

このシステムは、リアルタイム分析により、最大 3 つの独自の蛍光色素を追跡することができました。これにより、陽性結果、単指数関数的流出イベント、複雑な動力学、脂質侵入、および膜破裂の正確な識別が容易になります。一度習得すると、この手法は、チップ調製、サンプル調製、イメージング、分析などの連続したステップで実行でき、プロトコル全体をモジュール化できます。