固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）

本手順では、寿命、生殖、および代謝への影響を調べるため、海塩培地を用いた標準的なアガロースプレート上で食事制限を行います。まず、餌として使用する細菌の濃度を正確に測定します。次に、細菌培養液を適切な濃度まで適切に希釈します。

次に、死滅させた細菌を含むベースSDRプレートを調製します。最後に、齢同期させた線虫集団を用いてSDR実験を行います。産卵数および寿命の測定結果から、産卵の遅延と減少、ならびに平均寿命の延長が示されます。

AZA培地を用いたDianなどの手法と比較して、本手法の主な利点は、多くの研究室で食事制限実験に使用されている標準的なAGAベースの固形プレート上で全ての実験が行えることです。餌として使用する各細菌株について、個別の検量線を設定してください。LBアガー上の新鮮なストリークからE. coli OP50細菌の単一コロニーをピックアップし、3 mLの液体LBブロス培地に接種し、37 °Cのシェーカーで一晩培養します。この一晩培養した培養液の2倍連続希釈系列を調製します。

次に、分光光度計を用いて、各希釈液の600 nanometersにおける吸光度を3連で測定します。さらに、各細菌懸濁液を100万倍に希釈し、各希釈段階の細菌懸濁液0.4 millilitersを100 millimeter lb agriプレートに均等に播種し、37 degrees Celsiusで18 to 24 hours培養します。各プレートに形成された細菌コロニー数を計測し、各サンプルの1milliliterあたりのコロニー形成単位（CFU）を算出します。

次に、細菌濃度に対するOD 600をプロットし、線形回帰分析を行って、測定されたOD 600値とOP 50細菌濃度の関係を明らかにします。本手法では、ad libitum給餌条件には1×10¹¹ CFU/mLの細菌濃度を、最適なDR給餌条件には1×10⁸ CFU/mLを使用します。ただし、完全な用量依存的な関係を確立するためには、4〜6種類の異なる細菌濃度が必要になる場合があります。

SDRおよびその応答のため、e coli OP 50細菌の単一コロニーを用いて、3 mLの液体LB培地で接種液を調製し、37 °Cのシェーカーで6〜8時間培養します。必要に応じて、OP 50培養液を500 mLのLB培地を含む新しいフラスコに移し、細菌が飽和状態に達するまで一晩培養します。

OD 600で吸光度を測定するため、OP 50培養液の適切な希釈液を調製します。細菌濃度を決定するには、1500 Gsで20分間遠心分離して細菌をペレット化します。上清を除去し、細菌を1×10¹² CFUs/mLの濃度で再懸濁します。

次に、1 mLあたり1×10¹²から1×10⁷ CFUの範囲で、6つの異なる濃度の細菌培養液を10 mLずつ調製します。60 mmの固化したNGMプレートの中心に、細菌培養液0.2 mLをピペットで滴下します。プレート表面に傷がつくと、線虫がアガロース内に潜り込んでしまうため、ピペットチップがプレート表面に触れないように注意してください。

プレートを37 °Cのインキュベーターに1時間置きます。次に、細菌の増殖を抑制するため、各プレートに100 mg/mLのcarbonic soin 10 µLと50 mg/mLのcan mycin 10 µLを添加します。異なる濃度の抗生物質で細菌を死滅させたプレートは、今後の使用に備え、4 °Cで最大1ヶ月間保存してください。

工場全体で同じバッチのプレートを使用することが望ましいため、十分な数のプレートを準備し、保管しておくことが重要です。細菌の生存率を確認するため、少なくとも1〜2日前に予備実験を行ってください。SDRプレートから細菌を一部掻き取り、carbonic、sein、およびantimycinを含む空のN GMプレートに塗布します。

プレートを37 °Cのインキュベーターに6〜8時間置き、細菌の増殖がないことを確認します。寿命解析や子孫産生プロファイリングなど、多くのSDR関連研究では、年齢を同期させた線虫集団の調製が不可欠です。白金線虫ピックアップ針を用いて、生殖的に活性な成虫20〜30匹を数枚の通常のNGMプレートに転移させます。

OP 50を用いて行います。実験に必要な卵の数に応じて、より多くの成虫が必要になる場合があります。卵を産み付けさせるため、プレートを20 °Cで4時間放置します。

プレートから成虫を取り除き、プレートに卵があるかを目視で確認します。プレートを20 °Cで引き続きインキュベートし、子世代がL4後期から成虫1日目の段階まで成長するようにします。20 °CにおけるN2野生型線虫の場合、通常これには3日かかります。

寿命解析のため、10〜12日目の成虫をSDRプレートに移し、食事制限を開始します。十分な統計学的検出力を得るため、各SDR条件につき合計60〜100匹の虫を使用してください。

すべての虫が死滅するまで、2〜3日ごとに各虫の生存率をスコア判定します。重要な点として、飢餓を防ぐため、1日おきに虫を新しいSDRプレートに移してください。この検量線は、OD 600に対するOP 50濃度の関係をプロットしたものです。

線形回帰分析によって作成された方程式は、今後の OP 50 細菌濃度のすべての計算に使用できます。本研究では、異なる線虫系統の平均寿命に対する慢性的 SDR 処置の影響を、野生型線虫の SDR に対する通常の用量依存的反応と比較して評価します。SDR による寿命延長効果は DR2 の過剰発現によって部分的に抑制されますが、DAF 16 MU 86 変異は SDR 誘発性の寿命延長に影響を与えません。

このビデオを視聴することで、Sea Eleganceにおける標準的なAGAベースのプレイでDianをどのように行うかについて、十分に理解できるはずです。