ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

本実験の全体的な目的は、天然の膜環境におけるタンパク質または膜貫通ドメイン（T MD）のリガメント化傾向を調査することです。これは、目的の膜貫通ドメインを、ペリプラズムへの局在化のためのマルトース結合タンパク質および転写リポーターとしてのtox Rと結合させたキメラタンパク質としてE. coliで発現させることで達成されます。膜貫通ドメインが誘導するリガメント化は、tox Rの二量体化とLXi転写の活性化をもたらします。第二のステップとして、細胞を溶解してONPGで処理します。ONPGはβ-ガラクトシダーゼによって加水分解され、光吸収種であるo-ニトロフェノール（ONP）になります。

次に、405 nmにおける光の吸光度を測定することにより、ONPレベルを定量します。膜貫通ドメインのレベルを決定するために、リガンド化の結果から、tox Rリポーターアッセイに基づく膜貫通ドメインのリガンド化傾向を明らかにします。SDS-PAGEや蛍光法などの既存の生物物理学的手法に対するこの手法の主な利点は、界面活性剤ミセルのような膜模倣システムではなく、大腸菌（e coli）での発現により、天然のリン脂質二重層における膜貫通ドメインの挙動を研究できる点にあります。

この手法は、膜貫通ヘリックスの会合に関与する主要な構造的特徴の解明など、膜タンパク質分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルの開始前に、NheIおよびBamHI制限酵素部位に挟まれた目的のTDSを表す、商業的に合成されたオリゴヌクレオチドから、必要となるキメラタンパク質を発現する7つのプラスミドを調製しておきます。プラスミドの調製後、fhk 12コンピテントセルを氷上で緩やかに解凍します。解凍後、細胞を15 mL培養チューブに移し、各チューブに200 ngの各プラスミドDNAを加え、細胞を氷上で30分間インキュベートします。

次に、細胞を42 °Cで90秒間ヒートショックし、続いて800 µLのSOC培地中で2分間氷上で静置します。その後、サンプルを37 °Cで1時間振とう培養します。培養後、15 mL培養チューブを用い、クロラムフェニコールおよびアノースを含む5 mLのLB培地に、形質転換混合液50 µLを各サンプルにつき3反復で接種します。最後に、サンプルを37 °Cで20時間振とう培養します。全てのリガンド化を測定するため、TDS β-ガラクトシダーゼ活性を決定します。

まず、プレートリーダーを28°Cに予熱します。記載のプロトコルに従い、Zバッファーストックを用いて新鮮なZバッファー溶液を調製します。Zバッファークロロホルムをチューブからリザーバーに移しますが、その際、Zバッファークロロホルムの上層にある水層のみをピペッティングするようにしてください。

正確なピペッティングを行うため、格子状の線が描かれた紙の上に96ウェルプレートを置きます。96ウェルプレートの各ウェルに100 µLのZ buffer chloroformを分注し、続いて各培養液を5 µLずつ4連（quad）で加えます。この操作を2回繰り返します。ブランクとして使用する4つのウェルには、培養液を加えないでください。プレートのOD 595を測定し、細胞密度を決定します。

プレートのすべてのウェルに Z buffer SDS を 50 µL 加えます。次に、プレートリーダー内でプレートを 10 分間振とうして細胞を溶解させます。細胞溶解後、すべてのウェルに ONPG 用の ZPA を 50 µL 加えます。プレートをプレートリーダーに戻し、20 分間、30 秒ごとに OD 405 を測定します。

ブランクで正規化したMiller単位の算出により、β-ガラクトシダーゼ活性レベルを決定します。コンストラクト間でタンパク質発現量が同等であることを確認するために、ウェスタンブロッティングを行います。まず、3連で培養した培養液を50 µLずつ合わせ、マイクロ遠心機を用いてサンプルを遠心分離します。

ピペッティングにより上清を除去し、再懸濁します。残ったペレットを2×サンプルローディングバッファーに懸濁させ、各サンプルを7.5 µLずつ標準的な8%ゲルにロードし、125 Vで1時間5分間、電気泳動を行います。転写後、メンブレンを抗M-V-P-H-R-P複合抗体でインキュベートしてキメラタンパク質を可視化します。キメラタンパク質は約70 kDaに観察され、場合によっては48 kDa付近に分解産物が見られることがあります。

内在性MVPは45 kilodaltonsでも観察されます。キメラTMD構築物の適切な膜挿入を評価するため、マルトース結合タンパク質欠損PD 28細胞株が使用されます。マルトースを唯一の炭素源とする最小培地で培養した場合、ペリプラズムに正しく局在するマルトース結合タンパク質を含む膜貫通発現産物を発現している細胞のみが生育可能です。fhk 12細胞と同様の手順でPD 28細胞を形質転換し、2 mLのLB培地に接種してください。

インキュベーション後、細胞を37°Cで300 RPMで振とうしながら一晩培養します。遠心分離により細胞をペレット化し、2 mLのPBSで再懸濁し、太いチップを用いて穏やかにピペッティングして洗浄します。ペレット化した後、再びPBSで2回目の洗浄を行い、最後に遠心分離して1 mLのPBSで再懸濁します。

再懸濁した細胞 25 µL を用い、5 mL の最小培地を接種します。37 °C で 15 時間、振とう培養します。各サンプル 200 µL を 96 ウェルプレートに移し、プレートリーダーを用いて OD 595 を測定します。

この工程を25時間まで2時間ごとに繰り返します。マルチスパン膜貫通膜内蔵タンパク質である latent membrane protein one の各膜貫通ドメインにおけるリガンド化傾向を、tox R転写レポーターアッセイを用いて解析しました。膜貫通ドメイン5は、ポジティブコントロールである確立された二量体化配列 GPAA に匹敵する高いMiller単位を示し、強いリガンド化傾向があることが証明されました。

膜貫通ドメイン5のD150Aにおける有害な変異は、LMP1に結合する配列の能力を低下させます。TM1は有意に結合せず、非形質転換FHK 12細胞であるブランクのシグナルをわずかに上回る非常に低いミラーユニットシグナルを示します。このビデオを視聴することで、目的の膜貫通ヘリックスが天然の膜環境において高次複合体を形成する能力があるかどうかを判断する方法を十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、大きな誤差を避け、気泡が混入しないように、96ウェルプレートへのピペッティングを極めて慎重に行うことが重要です。