三次元光学分解能光音響顕微鏡

本手順の総合的な目的は、非侵襲的かつラベルフリーな微小循環の生体内（in vivo）光学分解能光音響顕微鏡（PAM）の実証です。まず、実験動物を麻酔させることでこれを達成します。手順の第2段階として、光学分解能光音響顕微鏡のイメージングヘッドを移動させて関心領域を positioning し、その後、スキャンパラメータを設定して画像取得を開始します。

最終的に、多波長実験データの計算を通じて、総酸素濃度とヘモグロビン酸素飽和度の分布が得られます。光解像光音響顕微鏡は、レーザー励起と超音波検出に基づいています。短パルスレーザービームを生物組織に集光させます。

光吸収によって一過性の加熱が生じ、それに続いて超音波が放出され、それを検知することで画像が形成されます。光音響顕微鏡（PAM）の独自の利点は、非接触での検出が可能であることと、光吸収に対する極めて高い感度を備えていることです。対照的に、既存の反射型または光学顕微鏡技術は、主に光散乱や蛍光に感度を持ちます。光吸収のin vivoでのラベルフリー高解像度イメージングを可能にするPAMは、神経学、眼科学、血管生物学、皮膚科学などの幅広い生物医学分野で応用されています。

光学解像光音響顕微鏡（pamm）は、光学コンポーネントと超音波コンポーネントの両方で構成されています。光学照射光源には、固体パルスレーザーで励起される色素レーザーが用いられています。出力されたレーザービームは、中性密度フィルターで減衰され、シングルモード光ファイバーに結合されて導光されます。これにより、生体試料ではなく顕微鏡のイメージングヘッドを機械的に走査させ、マルチモードレーザービームをシングルモード光ファイバーに効果的に結合させることが可能になります。

まず、直径50 µmのピンホールでフィルタリングを行います。ピンホールは、その直径を基本モードビームの直径に合わせるため、コンデンサーレンズの焦点からわずかに離れた位置に配置します。回折限界に近い光学フォーカスを作成するため、シングルモードファイバーの出力光をコリメートし、顕微鏡対物レンズの背面開口部を満たすようにします。

超音波検出には、超音波トランスデューサーに接続された自作のアコースティック光学ビームコンバイナが使用されます。このコンバイナにより、光照射と音響検出を同軸上に整列させます。コンバイナの底部には球面キャビティが研磨されており、水中で開口数0.5の音響レンズとして機能し、中心周波数50 megahertzにおいて43 µmの音響焦点径を実現します。

最初の調整では、パルスエコー超音波を用いて音響焦点面の位置を特定すると効率的です。パルスエコー超音波信号が最大になるまで、イメージングヘッドを垂直方向に調整します。検出感度を最大化するため、光学焦点と音響焦点を一致させます（共焦点）。

黒色の絶縁テープなどの光吸収ターゲットを、音響焦点面に配置します。次に、光音響信号が最大になるように光焦点位置を調整します。また、PAMシステムには、電子増幅器とアナログ-デジタル変換器、メカニカルスキャナー、およびスキャナコントローラーが含まれています。

デジタル化された信号は、画像形成のためにコンピュータに転送されます。ソフトウェアは、生データを一連の断層走査画像に変換します。顕微鏡ヘッドが物体をラスタースキャンすると、記録された画像は、個別の断層画像、2D最大振幅投影画像、または3Dレンダリングとして表示できます。

顕微鏡のイメージングヘッドを収容するために水槽を使用します。ペトリ皿にイメージングウィンドウを切り抜き、超音波および光学的に透過性のあるポリエチレン膜で密封します。物体から発生した光音響波は、まず物体とポリエチレン膜の間の超音波ゲルによって、次いでペトリ皿内の脱イオン水によって、超音波検出器に音響的に結合されます。

これらの発明と、利用可能な光学レーザーおよび超音波トランスデューサの応用によって、光音響（PAM）システムが構成されています。次のセグメントでは、このシステムを用いて生体マウスの微小血管をイメージングします。イメージングする動物がヌードマウスでない場合は、実験の24時間前に脱毛を行うことが理想的です。

これにより、皮膚血管の刺激状態が回復します。医療用酸素で気化させた3%イソフルランを用いてマウスを麻酔しました。一般的な流量は分あたり1〜1.5リットルです。

動物の体重に応じて投与します。実験を通して1%のイソフルランで麻酔を維持し、足指へのピンチ刺激を行ってマウスが完全に麻酔されていることを確認してください。マウスをステレオタキシス固定台に移動させ、ヒーティングパッドを用いて体温を37 °Cに維持します。

次に、耳をプラスチックプレートの上で平らにします。その後、耳の上に超音波ジェルを塗布します。ジェルの内部に気泡が入らないように注意してください。

また、乾燥や不慮のレーザー損傷を防ぐため、眼に眼用軟膏を塗布します。その際、アプリケーターで眼に直接触れないように注意してください。次に、耳をイメージングウィンドウの下に配置し、超音波ジェルが膜の底部に接触するまで動物ステージをゆっくりと上昇させます。

耳をメンブレンに押し付けると耳の血流に影響を与える可能性があるため、ソフトコンタクト（緩やかな接触）が必要です。次に、動物の生理学的状態をモニターするために、いくつかの注意点を確認します。マウスの脚または尾にパルスオキシメーターを装着します。

次に、音響レンズが脱イオン水に浸かるまでイメージングヘッドを下げ、音響レンズの下に溜まった気泡を取り除きます。レーザーを外部トリガーモードに設定し、テストスキャンを開始します。光学焦点と音響焦点の両方が耳の中央に位置するように、イメージングヘッドのZ位置を調整します。

次に、スキャンパラメータを設定し、正式な画像取得を開始します。総ヘモグロビン濃度を測定するため、波長をオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンのモル吸光係数が等しくなるISO等吸収点に設定します。

ヘモグロビン酸素飽和度を測定するために、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンのモル吸光係数に顕著な差がある波長を2番目の波長として設定します。終了後、マウスの耳を洗浄し、マウスをインキュベーターに入れます。環境温度を37 °Cに設定し、マウスが覚醒したら、自然に動物飼育施設に戻してください。

この最大振幅投影画像は、570 nmでo-PAMを用いて撮影した生存ヌードマウス耳の血管解剖学的構造を示しています。この投影画像は、同じ耳におけるヘモグロビンの酸素飽和度を示しています。これは、等吸収波長である570 nmと、デオキシヘモグロビン吸収優位波長である561 nmで取得した画像から算出されています。

囲み領域を拡大すると、ORPMの解像度が確認できます。密に配置された毛細血管網が明確に捉えられています。このビデオでは、システムの構成、生体内でのシステムアライメント、実験手順、および機能イメージングスキームを含む、ORPMの典型的な実験プロトコルを実演しました。

装置の設計と操作において最も重要な側面の1つは、光学・音響の共焦点アライメントであり、これは光音響顕微鏡のイメージング感度と光学解像度にとって極めて重要です。深部浸透型の音響解像度光音響顕微鏡および光音響コンピュータ断層撮影との組み合わせにより、in vivoでの機能的および分子イメージングが可能となり、細胞、組織、そして臓器に至るまで、複数のスケールで同一のコントラストを用いてイメージングできます。このようなイメージングの拡張性は、微視的な研究室での発見から巨視的な臨床実務に至るまで、マルチスケールシステム生物学およびトランスレーショナルリサーチに革命をもたらす可能性を秘めています。