マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

本手順の全体的な目的は、広範なイメージング領域において、生物学的試料のレンズフリー・オンチップ3次元イメージングを実現することです。これは、まず試料をセンサーチップ上に直接配置し、部分的にコヒーレントな照明を照射することによって達成されます。次のステップでは、光源を異なる位置に横方向に移動させて記録を行います。

サンプルのサブピクセルシフトさせたホログラフィック画像。次のサブピクセルシフト。トモグラフィーイメージングのために、照明の倍数でホログラフィック画像が記録されます。

最終ステップはデータ処理であり、ここで取得したデータセットをデジタル再構成することで、最終的にサンプルの3次元断層画像を得ます。従来の光学顕微鏡などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、コンパクトな構成でハイスループットなイメージングが可能であることです。これにより、当プラットフォームはラボオンチッププラットフォームとの統合に特に有用となります。

本レポートでは、静止サンプルのトモグラフィーに向けたベンチトップ実装のための基本的なイメージングセットアップについて説明します。キセノンランプを備えたモノクロメータを調整し、中心波長450から650 nm付近で約1から10 nmのスペクトル幅を持つ出力を得ました。この部分的にコヒーレントな光は、マルチモード光ファイバーに結合され、システムに導入されます。

照射角度を変更するため、光ファイバーを電動回転ステージに取り付けます。光源を取り付けた電動ステージを2次元リニアXYステージに設置し、検出のために特定の角度で光源の面内シフトを行います。ピクセルサイズ2.2 microns、5メガピクセルのCMOSセンサーアレイを使用します。

検出器は、試料の広視野ホログラフィック画像を記録するために使用されます。大きな照明角度においてセンサーが十分な光を受光しているかを確認するため、センサーアレイを光源の回転軸と同じ軸平面に配置することが極めて重要です。レンズフリー光学的断層撮影では、細胞や微生物など多様な物体をイメージングできますが、ここではメスまたはスパチュラを用いて、ウミムカシ試料の3次元顕微鏡観察を行うことでその基本原理を実証します。

シーラー器官を培養したペトリ皿から、AGAを少量切り出します。一辺が数ミリメートルの立方体状の断片には、数百匹の線虫が含まれています。このアガロースの小片を、1 mLの脱イオン水が入ったポリプロピレン製バイアルに入れます。

30秒から1分間、穏やかにボルテックスします。10分から15分後、虫がアガーから脱出して脱イオン水の中に入ります。ここで、虫を一時的に固定するために、1 mLの5から10 mMのLimaを用いるため、虫は小さすぎて見えないことに注意してください。

溶液を加え、10分間待機します。バイアルの底から5〜10 µLのサンプルをピペットで吸い取り、2枚のカバーガラスで挟みます。一時的に固定された多数の線虫を含むこのサンプルを検出器に設置し、データ収集を開始します。

デモンストレーションのため、一般的なレンズフリー光トモグラフィー（LOT）実験における画像取得の手順を本セクションにまとめますが、全工程は独自に開発されたLabVIEWインターフェースによって自動化されています。手動での操作を開始するには、回転ステージの初期角度を-50度に調整します。ここで、0度は光源の垂直位置に対応します。次に、XYステージの初期位置をホームポジションである0, 0に調整します。

回転ステージの角度を変更せずに、検出器のダイナミックレンジを最大限に活用できるよう露光時間を調整し、画素の飽和が起こらない範囲で可能な限り明るい画像になるようにします。各地点で9枚の画像をキャプチャします。XYステージを3×3の正方形グリッド状の新しい位置に移動させ、各画像が前の画像に対して約1/4ピクセル分ずれるようにします。

オブジェクトの種類や信号対雑音比によっては、各角度でより多くの画像を取得することで解像度が向上する可能性があります。初期角度で9枚の画像を収集した後、XYステージの位置を0, 0の位置に戻します。次に、回転ステージの角度を2度ずつ増加させ、正の50度に達するまで調整します。

新しい角度での各増分ごとに、上述の手順を繰り返します。角度の増分は、撮影時間と結像解像度の最適化に応じて、より細かく、あるいは粗く設定することが可能です。データ収集後、51通りの異なる照明角度に対してそれぞれ9枚のサブピクセルシフト画像を含む、計459枚の画像セットが取得されます。

9枚の画像からなる各セットに対し、ピクセル超解像アルゴリズムを用いてデジタル処理を行い、1枚の高解像度投影画像を取得します。その後、角度ごとのホログラムのピクセル超解像結果をデジタル再構成し、51枚の投影画像を得ます。ここに、ノートパソコンを使用したデータ処理の様子を示します。

グラフィカルプロセッシングユニット（GPU）を使用することで、全視野の再構成は1秒未満で完了します。次に、これら51枚の投影画像をTom OJAプラグインを用いて逆投影します。Image Jの場合、まず投影画像をImage Jに読み込み、その後にTom OJプラグインを起動します。

各投影画像に対する視野角を規定するルックアップテーブルをOJにロードします。重み付け逆投影法を用いることで、試料の3次元断層画像を得ることができます。ここでは、サンプルを検出器アレイの最上部に直接配置することで、レンズフリー光学断層法の広い視野を実証しています。物体のホログラフィック画像は24 millimeter squareの視野で記録可能であり、これは有効面積がより大きな次世代の検出器アレイを使用することで、さらに拡大させることができます。

検出器アレイのピクセルサイズが記録されるホログラム画像の解像度を制限しますが、ピクセル超解像技術によってこの問題は軽減されます。ここに示しているのは、ピクセル超解像処理を施したホログラムと、それに伴い3つの異なる照明角度でサブマイクロメートル空間解像度を実現した再構成投影画像です。これらの投影画像は、断層撮影画像再構成技術を用いて組み合わせることで、検体のTOM断層像を算出できます。ここでは、虫の前端を通過するXY平面上の3つのスライス画像を示しています。外径約5 µmのほぼ円柱状の構造であるため、予想通り、咽頭管はZ = 8 µmのスライスにおいてのみ確認できます。

さらに、XZ平面の断面画像では、虫の境界と内部の咽頭管が明確に示されており、咽頭の3Dイメージングに成功したことが分かります。この技術が発展すれば、数十ミリメートルに及ぶチューブ状のイメージング領域において、研究者が三次元顕微鏡観察を行う道が開かれる可能性があります。したがって、レンズフリー光学断層撮影法は、レバノンチッププラットフォームにおけるハイスループットなイメージングアプリケーションにとって有用なツールとなり得ます。