蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

このビデオでは、化学ライブラリの高スループットスクリーニングや環境汚染物質の検出を行い、化学物質や環境因子が特定のタンパク質活性に及ぼす影響を評価するための、蛍光標識CL gans株の培養および分注方法を実演します。CL elganにおいて、まず線虫の餌となる細菌培養物を調製し、GFP転換された同期化した線虫を培養します。

その後、0.5から2百万匹の虫を回収して洗浄し、3枚の84ウェルマイクロタイタープレートに分注します。次に、化学ライブラリーからの低分子化合物や、水、食品、土壌などの試験サンプルを虫に添加します。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて虫の蛍光を測定します。

蛍光強度のデータ解析により、誘導性転写経路を調節する低分子化合物や、環境汚染物質の検出を可能にする化合物を明らかにすることができます。in vitro試験や細胞培養ベースのアッセイなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、in vivoで毒性があるか、あるいは不活性な化合物に時間を費やすことがない点にあります。このハイスループット手法は、多様な誘導経路を調節する低分子化合物の同定に役立ちます。

本手法は低分子化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングのために開発されましたが、食品や環境試料中の汚染物質のバイオセンシングにも適用可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるAndrew Dineと、博士研究員のQ longが行います。細菌用線虫餌を事前に準備しておいてください。

50 µg/mLのストレプトマイシンを添加した500 mLのTerrific Brothに、5 mLの飽和したE. coli OP 50を接種することから始めてください。培養液をシェーカーに設置し、37 °Cで一晩培養します。

翌日、培養液を10本の50 milliliterチューブに分注します。次に、チューブを冷却遠心機にかけ、2,500 RCFで20分間遠心分離します。遠心分離後、各細菌ペレットを10 millilitersの液体線虫増殖培地（NGM）に懸濁させます。

懸濁液を水平方向に振盪させます。細菌を再懸濁させるため、フロアシーカーで15分間振盪します。次に、細菌培養液を4 °C、2,500 RCFで20分間遠心分離します。

NGMをデカントし、細菌ペレットの重量を測定します。次に、同量のNGM緩衝液を加え、ボルテックスでペレットを再懸濁します。最後に、再懸濁した細菌培養液を3 mLずつ15 mLチューブに分注し、使用時まで−20 °Cで保存します。

このデモンストレーションでは、例として、ストレスを誘導するXeno Duke loanが転写因子Sskn oneに及ぼす影響を測定します。Sskn oneは、酸化ストレスおよびxenobiストレス時に細胞保護遺伝子を活性化することが知られています。2つの蛍光コンストラクトを保持するTrenchgenic c gansラインVP 5 96の大規模培養を調製します。

VP 5 96 系統のワームは、転写因子の活性をモニタリングするために用いる GFP を駆動する GST four プロモーターと、ワーム数の標準化に使用する RFP を駆動する Sskn one および DOP three プロモーターの両方を発現しています。

DOP threeはドーパミン受容体のプロモーターであり、全身のニューロンで構成的に発現しています。本例では、ゼノバイロンがsskn oneを強力に活性化し、GST fourプロモーターから発現するGFPの量を増加させることを示します。培養の準備として、150 millilitersのNNGM緩衝液、1.5 millilitersのLB、150 microlitersの1 molarコレステロール、および75 microlitersの100 milligrams per milliliter Streptomycinを混合します。LBを添加することで、線虫がガラス器具やプラスチック器具に付着するのを防ぐことができますが、この量では細菌の増殖を維持するには不十分です。

混合液をフィルター滅菌し、滅菌済みの1リットルフラスコに移して、GR成虫から卵を放出させるために静置します。遠心分離を行い、上清が透明になるまでNGM培地を交換して、虫から細菌を洗浄します。さらに、滅菌水に再懸濁して再度遠心分離を行い、2回目の洗浄を行います。

上清を除去し、チューブに3.75 millilitersの滅菌水を満たします。1 milliliterの家庭用漂白剤と250 microlitersの10 normal 水酸化ナトリウムを加え、直ちに5〜6回転倒混和します。線虫を漂白剤に4分間さらした後、チューブをローテーターに設置します。

チューブを実体顕微鏡下に置きます。成虫のほとんどが溶解しているはずです。チューブを15～20回激しく振って、残っている成虫の溶解を促進します。溶解が合計5分間完了した後、チューブがいっぱいになるまで滅菌水を加えます。

卵を回収するため、5〜6回転倒混和します。チューブを500 RCFで1分間遠心分離します。滅菌水10 mLで懸濁して遠心分離し、上清を除去する操作を3回繰り返し、卵を洗浄します。

次に、卵のサンプル100 µLに10 mLのNGM緩衝液を加えて100倍に希釈します。その後、顕微鏡下で5 µLのアリコート3回分をシャーレの蓋にピペッティングします。3つの独立した5 µLのアリコートに含まれる卵の数を数えます。

総卵数を推定するため、NGMバッファーを入れたフラスコに200,000個から200万個の卵を加え、20 °C、100 RPMで培養液を振とうさせる。卵をフラスコに加えてから少なくとも16時間後、滅菌済みセロロジーピペットを用いて、懸濁させた線虫培養液を約0.5 mL分取り出す。

滅菌済みのペトリ皿の蓋に、5 µLの液滴を3滴分ピペットで滴下します。この蓋を-20 °Cのフリーザーに1～2分間置き、ワームを麻痺させます。ワームが麻痺した後、実体顕微鏡を用いて5 µLあたりの生存した孵化ワームの平均数をカウントし、総数を推定します。

あらかじめ調製した凍結保存済みのOP 50細菌培養物を、ベンチ上に数分間置いて解凍します。次に、孵化した線虫500,000匹あたり3mLの50% OP 50を加えます。フラスコを20°Cで100 RPMで振盪させます。

線虫は約51時間でL4幼虫および若成体へと成長します。培養期間中は、視覚的な確認により細菌量などの状態を監視してください。培地が透明になった場合は、細菌を追加してください。

滅菌済みセロロジカルピペットを使用して、懸濁した線虫培養液を約0.5 milliliters標準NGMアガープレートに転移させます。実体顕微鏡で線虫を観察し、大部分がL4幼虫および若齢成虫であることを確認してください。明視野顕微鏡下では、L4幼虫は体の中心に腹側の透明なスポットが見られます。若齢成虫はそれよりもわずかに大きく、透明なスポットは見られません。

次に、線虫の培養液を滅菌済みの50 milliliterチューブに移します。チューブをフード内のテストチューブラックに設置し、未孵化の卵や発育不全の線虫を沈殿させます。これらは、発育した線虫よりもゆっくりと沈殿します。

10分後、孵化していない個体および未発達の個体を含む上清を吸引して除き、各ペレットに約10 millilitersのNGM緩衝液を加え、チューブを軽く回して虫体を懸濁させます。すべての虫体を1本の50 milliliterチューブに集めます。スイングバケット centrifugeを用いて500 RCFで30秒間遠心分離します。

次に、線虫を1% LB含有NGM 50 millilitersに再懸濁して洗浄します。これを3〜4回繰り返し、洗浄後に細菌を除去します。チューブにNGMおよびLBバッファーを満たし、50 millilitersにします。

これをスターバーを入れたカスタム線虫分注フラスコに注ぎ、スターラープレートの上に置きます。分注フラスコと分注カセットのデッドスペースを満たすには、最低でも約 20 milliliters または 60,000 worms が必要です。前述の方法で、5 microliter の滴を3回分取り、線虫の数を数えます。

NGMおよびLBを用いて、5 µLの液滴あたり12〜15匹の濃度に調整した後、3枚の84ウェルプレートにつき約35,000匹、または11.5 mLの虫体懸濁液が必要となります。10 µL用分注カセットをディスペンサーに装着し、70% ethanolでプライミングして滅菌します。その後、滅菌水でプライミングしてethanolを洗い流します。

分注カセットの先端をフラスコに挿入し、攪拌子の動きを妨げないよう、攪拌子の直上に位置させます。線虫がフラスコ全体で懸濁したままであることを確認してください。分注器を低速で設定し、2回のプリパルスでプライミングを行い、少なくとも10 millilitersの懸濁線虫を分注するようにプログラムします。

線虫がチューブ内で沈降するのを防ぐため、あらかじめ試験化合物を入れたマイクロタイタープレートに速やかに充填してください。ここでは、事前にマイクロタイタープレートにロードしておいた試験化合物を用います。Glow。ウェルに埃が溜まるのを防ぐため、プレートを透湿性テープで密閉します。

プレートを、アッセイに適した温度に設定したインキュベーター内のシェイキングプラットフォームに設置します。空気の流れが妨げられる可能性があるため、プレートを積み重ねないでください。ターゲットプレートをマイクロプレートリーダーにセットし、適切な励起および蛍光波長を用いて、各ウェルの蛍光強度を測定します。

GFPに使用するフィルターは励起波長 485 nm、蛍光波長 528 nmです。RFPに使用するフィルターは励起波長 540 nm、蛍光波長 590 nmです。プレートの読み取り後、GFPとRFPの比率を算出し、活性化化合物を含まないコントロールウェルの読み取り値で標準化することで、各処理から得られた蛍光強度の正確な倍率差を決定します。

ここで示すSSKN oneアッセイでは、染色体統合型デュアルレポーター株を使用し、ステレオ顕微鏡を用いて線虫を数え上げました。線虫の数は、分注量とR2値0.94、p値0.0001未満で相関しました。これは、分注量を調整することで、各ウェルに分注される線虫の数を制御できることを示しています。

これらの図において、左側に示されている1ウェルあたりの合計GFP蛍光および右側に示されている1ウェルあたりのRFP蛍光は、384ウェルプレート全体でウェル間再現性が非常に高い。XSは各ウェルで測定された相対蛍光強度を示す。実線は平均値を、破線は全ウェルの平均蛍光強度の上下3標準偏差を示しており、変動係数は9%未満であった。本図に示すように、384ウェルにおけるGST 4プロモーター由来のGFP蛍光は、DOP 3プロモーター由来のRFP蛍光と線形相関しており、R²値は0.62、p値は0.0001未満であった。

したがって、非誘導性のRFPレポーターを用いて、誘導性のGFPレポーターの標準化を行うことができます。GFPとRFPの蛍光強度の比率を算出することで、384ウェルプレート内の各ウェル間において高い再現性を得ることができます。

GFPとRFPの比率を算出することで、変動係数を6%以下に抑えることができ、ここで示されているように、DOP three promoter RFPレポーターがばらつきを低減できることが実証されました。SK N one活性化ゼノバイオティクスによるRFPに対するGFPの誘導は、384ウェルプレート全体で強固かつ高い再現性を示しており、すべてのコントロールウェルおよびdue GLOウェルの平均相対蛍光比を実線で示しています。コントロール平均の3標準偏差上およびdlo平均の3標準偏差下を破線で示しています。

一度習得すれば、線虫培養の開始は初日に約1時間で完了し、回収と分注にかかる時間は、適切に行えば約2時間で完了します。この手順を試みる際は、少なくとも60,000匹の線虫から開始し、分注中はそれらを懸濁状態に保つことが重要である点に注意してください。この手順に従ってスクリーニングを行うことで、例えば、他の誘導性経路のレポーター系統を用いたスクリーニングを実施し、開発後に他の経路のモジュレーターを構築することが可能です。

この手法は、ハイスループットスクリーニングやバイオセンシングの分野の研究者が、低分子のパスウェイモジュレーターを迅速に特定したり、環境汚染物質を検出したりするための道を開く可能性があります。このビデオを視聴することで、誘導性転写パスウェイのハイスループットスクリーニングや、環境汚染物質の複数サンプルの試験において、蛍光標識されたC. elegans株をどのように培養・分注し、測定するかを十分に理解することができます。