マルチ連絡ラミナーの電極の録音を使用してローカルネットワークの処理を検討

本手順の全体的な目的は、一次視覚皮質の異なる皮質層における個々のニューロンおよび局所フィールド電位が、感覚情報をどのようにコード化しているかを調べるための手法を記述することです。本手順では、まずコンピュータ制御のマイクロドライブシステムの構築について説明し、次いで一次視覚皮質での記録に使用する多接点ラミナー電極について説明します。

次のステップは、電極を標的となる脳領域まで進めた後、誘発電位パラダイムを実施することです。続いて、同期ソース構成に伴う極性の反転に基づき、電流源密度分析を用いて皮質層を特定します。本手順の最終ステップでは、受容野マッピングを行い、視覚刺激に対する神経活動の差異を分析します。

最終的に、感覚情報の符号化における層特異的な変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、私はテキサス大学ヒューストン医学部の大学院生のSarah Eaglemanです。マルチ電極アレイのような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、Uプローブを用いることで、一度の刺入で皮質の数ミリメートルにわたる神経活動を同時に記録できる点にあります。

こんにちは、ブライアン・ハンセンです。私はヒューストンのテキサス大学医学部の大学院生です。本手法は、情報が層特異的な方法で処理されているか、またどのように処理されているかを探究することで、神経科学分野における重要な疑問に答えることができます。

まず、電極駆動アセンブリを構築するために、ガイドチューブ、ガイドワイヤー、Dremel一式、設定用工具および部品、Uプローブを含む必要な工具と部品を準備します。ガイドチューブを測定し、記録装置に取り付けた際に、硬膜を損傷することなくその上に乗る十分な長さであることを確認します。次に、記録チャンバーの深さを測定した後、ガイドチューブを測定した長さ（約5〜7 cm）に切断します。

チューブ内部に金属片が入らないように注意してください。ガイドチューブの内径より細い硬いワイヤーを使用して、チューブ内部にある金属片を除去します。次に、ネームグリッドをネームベースに装着します。

クランプネジとグリッドネジを締めます。次に、記録領域（ROI）を特定し、マイクロドライブタワーをその領域の上に配置します。記録領域の特定後、ガイドチューブをグリッドの底部から挿入し、記録室から約1〜2 mm外に出るまで進めます。

次に、各NAマイクロドライブタワーに2つのクランプを取り付けます。モーターによって上部のクランプが駆動し、下部のクランプは固定または緩めた状態のいずれかに設定できます。上部のクランプは、Uプローブの補強チューブに取り付けられます。

ボトムクランプをガイドチューブに取り付け、少量の瞬間接着剤を塗布してガイドチューブを固定します。2つのクランプによって、システムの安定性と精度が確保されます。Uプローブの先端をガイドチューブの上端に慎重に合わせ、タワーをメインベースに固定できるまで、Uプローブをガイドチューブに通します。

サムスクリューでタワーの位置を調整し、Uプローブまたはガイドチューブに余計な張力がかからないようにします。ネームシステムをシリンダーベースに設置し、モーターケーブルを対応するタワーに接続します。複数のタワーを使用する場合、モーターケーブルとタワーを区別するために色分けされた結束バンドが使用されます。ネームソフトウェアプログラムを使用してUプローブを前進させます。これは、ターゲット位置を設定してUプローブをその位置まで自動的に前進させるか、またはネームソフトウェアのインターフェース上の「down」をクリックすることで行います。Uプローブを前進させ、チップの先端が少なくとも10 millimeters、ガイドチューブを通り越してネームチャンバーの末端を突き抜けるようにします。

インプラント記録チャンバーにベースを装着する前に、Uプローブをメタサイド活性化アルデヒド溶液に20〜30分間浸して滅菌します。その後、Uプローブとベースを滅菌水で洗浄してください。Uプローブを後退させ、チップがガイドチューブの直内側に来るようにして、ソフトウェアで位置を調整します。

「Zero all positions」をクリックします。記録チャンバーの埋込部にベースを取り付け、4本のネジをすべて締め付けます。その後、記録チャンバー側面のピンに合わせてベースを調整します。

4本のネジをすべて再度締め、ネームベースが recording chamber にしっかりと固定されていることを確認します。記録の進行に備えて、接地および参照手順に従い、U probe を接地し、フローティング状態にします。これは、接続されたワイヤージャンパーを配置することで行われます。

下部のコネクタでヘッドステージをUプローブコネクタに固定し、その後、アンプケーブルを接続して接地させます。まず、Uプローブを高速かつ強力に約1〜2 mm進めます。速度パラメータを0.1〜0.2 mm/sの範囲に、深度ステップを0.2〜0.3 mmに設定してください。

これらの値は、Uプローブが硬膜をきれいに穿刺できることを確実にするものであり、記録における重要な第一段階となります。硬膜を通過した後は、速度を0.50〜0.1 millimeters per secondに、深度ステップを0.5〜0.1 millimetersに下げます。目的は、組織に損傷を与えないよう、Uプローブを可能な限りスムーズかつゆっくりと前進させることです。

プローブが脳内に進入したことを示す兆候の一つは、LFPの振幅の変化とそれに伴うノイズレベルの低下です。電極がすべての皮質層にわたっていることを確認するために、全視野白色フラッシュ刺激に対する振幅の変化を測定します。時間経過に伴うLFP振幅の変化は、誘発電位解析の根拠となります。この解析により、皮質層を特定することが可能になります。

被験者に、100ミリ秒間白く点滅した後に黒に戻る全視野黒画面を提示し、受動的注視タスク中の誘発電位を測定します。この一連の流れを1試行とし、これを200回繰り返します。マルチチャンネル取得プロセッサのplexは、National Instruments社製PCIボードを介して、すべての連続データ信号を記録用コンピュータに直接保存します。

データの保存後、電流源密度分析のための信号処理を開始します。ヘッドステージおよびプリアンプボードのフィルタによって生じたLFP信号の時間遅延を補正するため、Plex社より提供されているソフトウェア補正FP alignを使用してください。この時点で、データはneuro explorerを用いてMATLABに転送されます。

各LFPチャネルは、遮断周波数を0.5 hertzおよび100 hertzとする標準的なハイパスフィルターおよびローパスフィルターを用いてフィルタリングします。各電極接点のフィルタリング後、各試行を特定して試行間で平均化し、各電極接点の平均LFP時系列を取得します。次に、各接点を時間の関数としてのLFP振幅を持つ行列に整理し、ワークスペースでCSD plotterと入力してMATLABのICSDツールボックスを実行します。連続データのサンプリング周波数がone kilohertzであるため、DTパラメータをone millisecondに設定します。

次に、皮質導電率の値を 0.4 Siemens per meter に設定します。これは nano peers per cubic millimeter 単位の電流源密度（CSD）に近似されます。また、電極位置を 0.1 のベクトルとし、0.1 から 1.6 まで 0.1 刻みで変更します。ここで 1.6 は接点の総数です。すべてのパラメータを入力したら、run をクリックします。CSDプロッターインターフェースで CSD プロファイルを確認し、それを新しい図に貼り付けます。

層プロファイルをプロットするために、MATLABのimage SCなどの共通関数を使用することができ、CSDデータを表現し、時間帯やセッション間での層の同定を比較するために、さまざまな平滑化アルゴリズムや正規化ルーチンを適用することが可能です。まず、第4層の底部におけるシンク・ソース構成に伴う極性の反転を特定するために、顆粒層に一次シンクが存在することを確認してください。層状CSDプロファイルを用いて、CSDプロット上のシンクに起因する負の極性を特定します。

次に、顆粒シンクの重心を算出します。解析により、シンクが最大であった時の接触数と時間からOIDが得られます。シンク中心（Centro）との接触を、0 µmにおける顆粒層の基準点とします。

参照点の上方および下方のすべての接点を分析し、3つの可能な層のいずれかにグループ分けします。Supra、granular、およびinfra granular層において、電極位置をシャッフルし、時間領域を不変に保つことで、granular sinkを検証します。シャッフル後、CSD行列を用いてOID解析を行います。

同様に、皮質深さに応じて電極の接点をシャッフルすれば、層特異性は消失するはずです。受容野を特定するには、まず受容野が存在する可能性のあるモニター上の位置に、逆相関刺激を提示します。この刺激は、45度、0度、90度、135度の4つの方向勾配で構成されています。

発火率マップに対してクラスター解析を行い、受容野を特定します。まず、各時間遅延における最大発火率の場所とその重心を算出します。次に、Centroとこれらの最大発火率の場所との間の距離を算出します。

各ニューロンについて独立して、40から120ミリ秒まで5ミリ秒間隔の伝導遅延における、各空間的な場所での発火率マップを計算します。すべての時間遅延において、OIDと周囲の最大発火率点との間の総距離を求めます。その距離が最小となる時間遅延が、受容野となります。

各細胞の受容野が特定された後、記録された集団のすべての受容野と重複し、かつすべての受容野の位置よりも大きい逆相関刺激を提示します。リアルタイムの発火率プロットを用いて、正しい受容野の位置が特定されているかを確認できます。最後に、主成分、スパイク幅、谷およびピークの特性などのパラメータに基づいた波形クラスタリングを実装したPlexon社のオフラインソータープログラムを使用して、スパイク波形を分類します。

急激に応答が変化する信号ユニットは必ず除去し、ここに示す以降の解析では、発火率が安定しているユニットのみを保持してください。皮質深さにわたる皮質層の局在化を時間関数のとして示すCSD解析の例では、記録セッションの開始から4時間後でも、super granular層、granular層、およびinfra granular層の位置は安定したままであることがわかります。CSDトレースは、特定の層に割り当てられたコンタクトの平均値を示しています。

この例では、約50ミリ秒で顆粒層のCSD振幅に明確な減少が見られます。層状電極を使用する際のもう一つの重要な解析は、ニューロンの受容野を正確に特定し、局在化させることです。これらのプロットの起点は固定点であり、これは黒いコンピュータ画面の中央に表示される小さな白い円です。

これらのプロットの色は、ダイナミック逆相関刺激に応答した各ニューロンの発火率を表しています。この図は、同一チャネルで分離されたスパイク波形の2つの例を示しています。クラスター解析は、主成分分析およびスパイク波形特性を用いて行われました。

平均的なスパイク波形を実線で示しています。標準偏差を破線で示しています。これらの手順を行う際は、慎重に電極を進め、進めた後に脳が十分に安定するまで十分な時間を置くことが重要です。

通常、この手順に従い、最後の前進から約 30 ～ 45 分後に記録を開始します。皮質層内および層間のネットワーク構造を研究するために、LFP Power や Spike Field synchronization などの他のスペクトル解析手法を用いることができます。