マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

この手順の全体的な目標は、E17マウスのニューロン組織を分離して関連付け、微小電極アレイ上のニューロンネットワークを培養、記録、および刺激することです。この方法は、学習と記憶の基本的なメカニズムに関連するネットワークダイナミクスの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、微小電極アレイが複数のサイトから同時に記録できるため、従来のガラスピペットによる単一サイト記録と比較して、空間的、時間的な分解能を向上させることができることです。

この方法は、学習と記憶のネットワークダイナミクスに関する洞察を提供するだけでなく、薬物毒性の調査や次世代の個別化医療のパラダイムの設計にも使用できます。このプロセスを視覚的に示すことは、解剖および解離プロセス中の組織の操作を、単にプロトコルを読むだけでは習得しにくいため、非常に重要です。アレイを調製するには、滅菌ピペットチップを使用して、各MEAの中心に40〜50マイクロリットルの解凍ラミニンを追加し、コントロールプレートに0.2ミリリットルのラミニンを追加します。

バイオフード内のすべてのMEAとコントロールディッシュを覆い、摂氏37度のインキュベーターに1時間移します。1時間後、滅菌パスツールピペットによる吸引を使用してMEAの中心から余分なラミニンを慎重に取り除き、表面を自然乾燥させてからめっきします。次に、L-15培地を4つの100mmシャーレに注ぎ、蓋をして、培地がぬるぬるした粘稠度を持つまで、マイナス20°Cの冷凍庫に約40〜60分間置きますが、固く凍結することはありません。

解剖の準備として、ガラスのペトリ皿を下向きにして、氷でいっぱいのトレイに置きます。次に、動物の下腹部に70%のエタノールをスプレーします。小さな手術用ハサミを使用して、下腹部の皮膚と皮下脂肪にV字型の切り込みを入れ、切り口を胸腔の遠位端まで伸ばして子宮を露出させます。

鉗子を使用して、胚の間の子宮を慎重に持ち上げます。子宮全体が自由になるまで、解剖はさみで結合組織を切り取ります。次に、子宮を70%エタノールで短時間すすぎ、血液を取り除き、冷たいL-15で満たされた4つのペトリ皿のいずれかに入れます。

その後、2対の細い先端の鉗子を使用して、各胚を子宮と内部胚嚢から放出します。解放された胚を冷たいL-15で満たされた2番目の皿に入れ、次に頭を3番目のシャーレに移し、体を4番目のシャーレに移します。バイオフッドでは、オートクレーブ滅菌した濾紙のくさびを冷やしたガラスのペトリ皿ステージに置き、濾紙の上に1つの胚の頭を置きます。

次に、虹彩はさみの下剪断の刃先を頭蓋骨の基部に配置し、下剪断を頭蓋骨の内面に対して脳から遠ざけ、後頭板を貫通し、次に頭頂板の間の正中線に沿って切り込みます。軟骨の前頭蓋骨プレートの間を吻側に切断し続けます。次に、後頭板の中心から始めて、中心の切り口の左右に垂直に切り込み

その後、小さなヘラを脳の腹面と下部の頭蓋骨プレートの間に慎重にスライドさせ、完全に脳の下になるまでスライドさせます。次に、へらを持ち上げて脳を取り出します。清潔なヘラを使用して、最初に嗅球を取り外し、次に前頭葉を台形パターンで解剖します。

次に、組織を保存培地が入った15ミリリットルの遠心チューブに移します。この手順では、2つの滅菌メスの刃を使用して組織をミンチにします。次に、2.5ミリリットルのDnaseパパイン混合物をペトリ皿のひき肉組織に加えます。

ペトリ皿を静かに回転させて、すべての組織が溶液中に自由になり、皿の底に付着していないことを確認します。その後、皿を摂氏37度のインキュベーターに15分間入れます。バイオフードでは、滅菌済みの広口径トランスファーピペットを使用して、すべての培地と組織を5ミリリットルの滅菌極低温チューブに移します。

同じトランスファーピペットの先端をチューブの底に近づけ、混合物を10〜15回静かにチテレートします。次に、解離した細胞混合物に2ミリリットルの温めたDMEM 5/5を加え、遠心分離チューブにキャップをします。反転させて穏やかに混合し、室温で573gで5分間遠心分離します。

バイオフッドでは、パレットを壊さずにすべての上澄みを捨てます。続いて、温めたDMEM 5/5を1ミリリットルをチューブ内のパレットに加え、細胞を再懸濁します。滅菌済みの小口径トランスファーピペットを使用して、混合物が均一になるまでゆっくりと上下にピペッティングしてパレットを分割します。

次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液を微量遠心チューブに移します。バイオフッドの外側で、微量遠心チューブ内の10マイクロリットルの細胞懸濁液に10マイクロリットルのトリパンブルーを追加します。次に、10マイクロリットルのトリパン青色細胞懸濁液を廃棄血球計算盤チップにロードして、細胞をカウントします。

バイオフードでは、滅菌マイクロピペットを使用して、50マイクロリットルの細胞懸濁液を各アレイの中心に移し、各コントロールシャーレに移します。次に、蓋をしたペトリ皿を摂氏37度に設定されたインキュベーターに3〜4時間置きます。次に、温めたDMEM 5/5を各MEAに1ミリリットルをそっと加えます。

MEAの内側の端に一度に1滴ずつ培地を慎重に追加し、細胞をアレイの中心から洗い流さないようにします。その後、各MEAにガス透過性FEPメンブレンを含むキャップを取り付けてから、インキュベーターに戻します。2日後、温めたDMEM+で皿から培地を引き出して、培地を完全に交換します。

ピペットの先端を慎重に内壁に置き、温めたDMEM+を1ミリリットル分注します+その後の給餌のために、皿から500マイクロリットルの培地を引き出し、500マイクロリットルの温めたDMEM+を再度分注します。この手順では、顕微鏡で隔日でディッシュサンプルを検査し、アレイ上の細胞被覆、および細菌または真菌による汚染を探します。培養物をインキュベーターから取り出す前に、温度コントローラーを差し込み、システムの電源を入れて、プリアンプの加熱ベースプレートが摂氏35度に達するようにします。

次に、キャップを付けた培養物をプリアンプに入れ、MEAの黒い線が基準グランドとよく揃うようにします。プリアンプの上部が固定され、カルチャーキャップがオンのままになるように、プリアンプのピンが揃っていることを確認します。次に、ソフトウェア環境でスタートを押して、信号の視覚化を開始します。

メインウィンドウで、[Spikes]、[Detection]、[Automatic] の順に選択し、標準偏差の値をマイナス 5 に変更し、[Refresh] をクリックしてしきい値をリセットします。信号を視覚化したら、[Stop]、[Record]、および [Play] をクリックしてアクティビティの記録を開始します。胚性マウスニューロンは60チャンネルのMEAに播種されており、各電極からのネットワーク全体のニューロン活動を同時に記録することができます。

これは、トレーニング前とトレーニング後の刺激に対する 8 つの電極からのアクティビティの代表的なラスター プロットです。縦の赤い線は刺激の時間を示し、黒い目盛りは活動電位を示します。事前学習では、チャネル全体の刺激パルスに対して即座に反応します。

トレーニング後、ネットワークはより長時間の活動反応を示し、刺激に対する即時の反応を示します。ここに示されているのは、学習済みの 12 個のネットワークと 10 個の制御ネットワークの平均で、学習済みのネットワークはスパイク周波数が大幅に変化したことを示しています。このビデオを見れば、胚性マウスからニューロン組織を分離して関連付ける方法、および微小電極アレイからニューロンネットワークを培養、記録、および刺激する方法について十分に理解できるはずです。