の活動の定量化シス調節エレメント

本手順の目的は、蛍光転写レポーターを用いてマウス網膜インプラントをエレクトロポレーションし、その発現量を定量化することです。まず、解剖によって新生マウスの網膜組織を単離します。次に、蛍光DNAレポーター構築物を網膜にエレクトロポレーションします。

手順の第3段階は、エレクトロポレーション後の網膜をインプラントとして8日間培養することです。手順の最終段階は、網膜外植片を回収し、蛍光レポーターの発現レベルを定量することです。最終的に、ex vivo外植片エレクトロポレーションとそれに続く定量データ解析を通じて、発達中のマウス網膜における異なるプロモーターレポーター構築物の相対的な発現レベルを示す結果を得ることができます。

私はジョー・コルボです。セントルイスにあるワシントン大学医学部の病理・免疫学部門の教員を務めています。本日は、光受容体特異的なCYS調節エレメントの活性を定量化することを目的とした、新生マウス網膜へのex vivo電極導入法のビデオプロトコルを提示します。このプロトコルの実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるシンディ・モンタナです。まず、眼球を採取する準備として、電極導入チャンバーとすべての器具を70% ethanolで滅菌します。

エタノールで手袋と作業台の両方を消毒し、手順全体を通して無菌状態を維持します。次に、組織培養用クリーンベンチ内で、1枚の滅菌済み60 mmペトリ皿に6 mLの解剖用培地を、2枚の滅菌済み35 mm皿にそれぞれ3 mLの培地をピペットで分注します。作業台に戻り、新生マウスの頭部と頸部を70%エタノールで消毒します。

ハサミを用いて迅速に脱頭した後、頭部を滅菌済みの100mmディッシュに移し、解剖顕微鏡下で小型ハサミを用いて頭皮を切り除き、眼球を露出させます。湾曲鑷子を用いて、眼窩から眼球を優しくすくい出し、解剖用培地を入れた35mmディッシュに配置します。電気穿孔法に用いるDNA 1アリコートあたり3〜4個の眼球が集まるまでこの操作を繰り返し、完了するまで眼球と解剖用培地を室温で保持します。

カミソリの刃と滅菌プラスチック転送ピペットの包み紙を70%ethanolで消毒し、カミソリを使って、眼球全体をピペットで吸い込める十分な高さでピペットの先端を切り落とします。広げたピペットを使用し、実体顕微鏡の高倍率下で、35 millimeterディッシュから60 millimeterディッシュへ眼球を1つ転送します。微細ピンセットを用いて、眼球表面から外眼筋や脂肪などの組織を除去します。

次に、視神経の根元をつまんで切り離し、除去します。網膜を分離するために、角膜縁の強膜に小さな穴を開けます。強膜と網膜色素上皮は、マットグレーである網膜組織に比べて光沢があるように見えます。2組のピンセットの爪を1本ずつ穴に挿入し、強膜とRPEをゆっくりと引き裂いて開けます。

レンズはそのままにしておいてください。幅を広げたピペットを使用して、切り出した網膜を培地が入った2つ目の35 mmディッシュに移動させます。すべての網膜を回収し、37 °Cの組織培養インキュベーターで保存します。

エレクトロポレーションを行う前に、組織培養用フード内で、エレクトロポレーションに使用するDNAの各分注量に対して、1枚の滅菌済み35 mmディッシュに解剖用培地を、もう1枚のディッシュに培養液を満たします。P 200ピペットを用いて、エレクトロポレーション用ディッシュのチャンバーを滅菌済み1 XPB Sで3回洗浄します。チャンバーに60 µLのDNA分注量を注入し、未使用のチャンバーには60 µLの1 XPBSを満たします。

電極をエレクトロポレーション皿に接続し、電撃装置に適切な設定を入力します。精密ピンセットでレンズ部分を持って網膜を掴み、エレクトロポレーションチャンバーに転送します。各チャンバーに最大4枚の網膜を配置してください。

レンズ部分が陽極に接続された金属棒に寄りかかるようにして、網膜を配置します。あるチャンバーから次のチャンバーへDNAが混入するのを防ぐため、チャンバーごとにピンセットを拭き取ってください。すべての網膜が整列したら、電極装置のスタートボタンを押します。

陰極に接続された金属棒に小さな気泡が生じるはずです。ピンセットを用いて電極を外し、電気泳動装置の電源を切ります。網膜をチャンバーの壁面から慎重に離します。

網膜をチャンバーから、解剖用培地を入れた35mmディッシュに移します。滅菌済みの転送ピペットを使用し、網膜を解剖用培地から、培養液を入れた35mmディッシュに移します。滅菌済みの6ウェル培養プレートの各ウェルにラベルを貼り、各ウェルに3 mLの培養液を満たします。

滅菌済みピンセットを用いて、円形のWatmanニュークレオフィルターを各ウェルの培地の上に浮かべます。この際、フィルターの光沢面を上にしてください。解剖顕微鏡を用いて、滅菌済み転送ピペットで網膜を1つずつ、レンズ側を下にしてフィルター上に移します。もし網膜がレンズ側を上にして置かれた場合は、再度ピペットで吸い上げ、やり直してください。

各ウェルに4個まで網膜を配置し、それぞれ別々の液滴に保持します。網膜をウェルに配置後、培養プレートを37 °Cの組織培養インキュベーターに移し、必要な時間培養します。通常、ここでは8日間の培養で、DNA構築物が網膜表面の1/4から1/3にわたって発現するという良好なエレクトロポレーション結果が得られます。

蛍光レベルは、CRE構築物を発現している均一にエレクトロポレーションされた領域を、網膜外の領域と比較し、その後コントロールのGFP発現で標準化することで定量されます。特に桿体光受容細胞が効率的に導入されていることが示されています。ここでは、2つの桿体特異的プロモーターが外核層においてGFPおよびDS redの発現を誘導した際のエレクトロポレーションの結果を示します。

ここで青色で示されているDPI染色による2つの発現パターンを重ね合わせることで、光受容体特異的な発現が明確になります。内顆粒層および神経節細胞層のいずれにおいても、発現は認められません。このビデオを視聴することで、網膜シス regulatory elements の活性を定量化することを目的とした、マウス網膜外植えの電気生理学的解剖および培養方法について十分に理解できたはずです。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。