開発マウス内耳への遺伝子導入による

Janeは、Oregon Health and Science UniversityのOregon Hearing Research Centerに所属するLing Wang、Han Jang、およびJohn Burgandyによる、in Vivoエレクトロポレーションを用いたマウス内耳の発達に関する研究に転向しました。こんにちは。私はJohn Burgandyです。私の研究室は、Oregon Health and Science UniversityのOregon Hearing Research Centerにあります。

私の名前はAngです。Johns研究室のポスター担当です。また、Johns研究室のリサーチアシスタントとしても活動しています。

本プレゼンテーションは4つのパートに分かれています。まず1つ目は腹側開腹術です。ここでは、ペントバルビタールナトリウムによる麻酔、麻酔の適切性の確認方法、角膜保護、手術部位の準備、消毒、マウス生存手術データシート、手術室、皮膚および腹壁を通る腹側正中切開、および子宮角の外部露出について解説します。

パート2は子宮経由の微量注入です。胚の透過照明、胚の向きの調整、微量注入、ピペットの作製、および胚発生11.5日目と12.5日目の耳胞への微量注入について実演します。パート3はin vivoエレクトロポレーションです。

パドル型電極の配置方法と、胚齢11.5日のマウスにおける電極法（エレクトロポレーション）による導入法を実演します。パート4では代表的な結果を示します。胚後期および出生直後の内耳（蝸牛）におけるGFPの発現を確認します。

これは、胎生11.5日に発現プラスミドを用いて耳嚢にin vivoエレクトロポレーションを行った結果である。パート1：腹側開腹術。母マウスの首の後ろの皮膚、尾、および左後肢をしっかりと保持して固定する。腹部を70% ethanolで拭いた後、ナトリウムペントバルビタールベースの麻酔薬を腹腔内投与する。

麻酔が効くまで、マウスをホームケージ内に4〜5分間置きます。足および尾へのピンチ刺激を用いて、麻酔の十分性を評価します。この母マウスは、尾へのピンチ刺激に反応して身震いしており、有害刺激に反応しなくなるまでさらに2分必要です。

角膜の乾燥を防ぐため、目の部位に滅菌眼科用軟膏を塗布します。被毛やフケの飛散を最小限に抑えるため、化学薬品用ドラフトチャンバー内で手術部位の準備を行います。腹壁を覆う皮膚を露出させるため、細かい刃のバリカンで被毛を剃ります。

完全な除毛を行うことで、術後の切開部位の治癒が促進されます。腹部皮膚の消毒は、70% ethanol、ベタジン、70% ethanolの順に交互に拭き上げることで行います。常に頭側から尾側に向かって拭き、毎回新しい手術用脱脂綿または綿棒を使用してください。

各回の消毒において、呼吸の深さと質を評価し、マウスが反応しないことを確認します。2回目の70% ethanolによる消毒の後、直ちにマウスを腹側を下にして滅菌ドレープの上に置き、加温パッドに2〜3分間置いて保温します。この時間は、マウス生存手術記録シートに術前データを記録するのに適しています。マウス生存手術データシートを補足情報として添付しています。

施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）が、術前、術中、および術後のデータをどのようにモニタリングするかを確認できるよう、データシートと動物ケアプロトコルを含めることを検討してください。手術対象動物1匹につき、ログシートを1枚作成します。通常、げっ歯類では必須ではありませんが、手術は無菌環境で行うことが推奨されます。

ワークサーフェスはブロワーモーターおよびプレナムハウジングから分離されているため、ユーザーに振動が伝わることはありません。マイクロインジェクションに際し、子宮内遺伝子導入を容易にするためにラミナーフローフードに加えた改造の概略図を補足情報として添付しました。主な変更点は、低出力のチャレンジ、トラックライティング用の切り欠き、機器の電源コード用の隠しコンセント、および周辺電気回路の配線経路です。手術室は、乳酸リンゲル液の電気的IVバッグ、温浴槽、XYZマニピュレーター、ステレオ蛍光解剖顕微鏡、ファイバー optic光源、および手術器具で構成されています。

フットペダルを使用して、マイクロインジェクター、エレクトロポレーター、およびフォーカスを起動させます。手術器具はオートクレーブで滅菌します。マウス1匹ごとに、ガラスビーズ滅菌器を使用するか、ニードルホルダーを再度オートクレーブにかけて再滅菌する必要があります。

Balli剪刀、リング鉗子、および血管鉗子が必須の器具となります。腹側正中線を切開し、血管鉗子で皮膚を把持してBalli剪刀で外皮を切り取り、切開線を10 to 14 Millimetersまで延長します。白線（linea alba）と呼ばれる腹側正中線の白色無血管結合組織帯を確認し、Balli剪刀で白線を切開します。

腸管や鼠径部の脂肪パッドを傷つけないよう注意します。直ちに、あらかじめ温めておいた滅菌乳酸リンゲル液で腹腔内を洗浄します。皮膚および腹壁の切開部位に出血がないか確認します。

鈍端鉗子による直接圧迫で、軽微な出血がある場合はそれを止血します。リング付き鉗子を用いて、左右の子宮角を体外に露出させます。鉗子のリング端の一方で右子宮角をそっと挟み、子宮を正中切開線方向へ引き出します。空いた手で母動物の側腹部を緩やかに操作し、子宮の把持を容易にします。

鉗子を用いて子宮を圧迫したり、引っ張り出したりしてはいけません。これにより子宮の血管系や胚に損傷を与える可能性があるためです。左子宮角についても同様に外在化処置を繰り返します。外在化したばかりの子宮角を、あらかじめ温めておいた乳酸リンゲル液で直ちに洗浄し、子宮とともに外に飛び出した腸管や内腸脂パッドを慎重に元の位置に戻します。

これはあまり頻繁に見られるケースではありません。第2部：子宮への微量注入。母体を長い作動距離の対物レンズの下に配置し、柔軟なケーブルファイバー照明を子宮壁に当てます。

空いた手の指で子宮を軽く押さえます。これにより、胚の向きの特定が容易になります。ファイバー optic ケーブルからの光は、胚の向きを正確に評価するために必要な最低限の強度に設定してください。

強光は子宮に熱を伝え、合併症を引き起こす可能性があります。片手で光ファイバーライトと子宮を保持し、空いた手の指を用いて、穏やかな触診により胚を再配置します。以下の3つのビデオによる顕微鏡ECクリップと、子宮内で観察される一般的な胚の向きについて実演します。

透過照明時に観察される顕微鏡像が表示されます。白黒ではありますが、子宮の透過照明によって生体内で胚の向きを検出することが可能です。この例では、胚は頭を下にした状態で、腹側が観察者側を向いています。子宮を前後に動かすことで、左右の後肢、尾、および左眼の頭部を確認できます。

この例では、胚は再び頭を下にした状態で配置されていますが、前後軸に対して約90度回転しています。子宮をゆっくりと前後に動かすことで、左後肢と左前肢を規定するパドル形状を確認することができます。また、後脳も明確に認められます。

胚は直立した状態で、左側が観察者に向いています。後脳に明るい領域として、形成されつつある第四脳室が認められます。また、左眼、左前肢、および左後肢も確認できます。

子宮に軽く圧力をかけることで胚の向きをわずかに変え、主頭静脈の主幹とその前枝および後枝（それぞれ白と黒のアスタリスクで表示）の検出を可能にします。後述するように、Otisは主頭静脈の前枝と後枝の中間に位置しています。Otis自体は、透過照明を用いて子宮越しに観察することはできません。

2つの連続したビデオ顕微鏡クリップを用いて、Otisアシストへのマイクロインジェクションに向けて胚を再方向付けする方法を実演します。ここでの目的は、頭部側方におけるotisの位置を補間することを可能にする胚の指標を特定することです。具体的には、胚を背側から側方の位置に再方向付けし、一次頭静脈を特定することを目指します。

背側において、中脳、第四脳室、および左前肢が確認できます。子宮に軽く圧力をかけることで、胚の向きを背側から側面へと変化させます。これにより、左眼、頭部、中脳、および第四脳室が容易に観察できるようになります。

アスタリスクで示された主頭静脈とその後枝も明確に確認できます。主頭静脈の前枝ははっきりと検出されません。ここでの目的は、子宮内微量注入に適した高倍率下で主頭静脈を特定できるよう、胚の向きを調整することです。

この側面視では、子宮血管、脱落膜帯、および左眼が確認できます。子宮に軽く圧力をかけることで胚の位置が移動し、第四脳室と左眼を検出できます。アスタリスクで示されているのは主頭静脈とその後枝であり、主頭静脈とその分枝はアメリカンフットボールのゴールポストのような形状をしています。

耳胞は子宮越しに視認することはできませんが、支柱の中央に位置しています。Lynnは1個の胚に対して注入シークエンスを開始しました。彼女は子宮を透過照明で照らし、マイクロインジェクションのために胚の向きを調整し、fast greenを満たしたマイクロインジェクションピペットを視野内に導入します。

マイクロインジェクション用ピペットは、X、Y、Zマイクロマニピュレーターで保持されるピペットホルダーに取り付けられています。マニピュレーターのマグネットスタンドは、テフロンベースの鋼板に固定されており、これによりマイクロインジェクションピペットの大まかな位置調整を容易に行うことができます。マニピュレーターの前進マイクロメーター制御ノブを使用して、ニードルを適切に前進させます。

作製したピペットは、マウス胚の初期Otis stageにおける外傷性マイクロインジェクションに不可欠です。水平型ピペットプラーを用いて、肉厚のホウケイ酸ガラスキャピラリーチュービングを延伸させます。Aに示すように作製されたピペットを、Bの矢印で示される外径約14から16 µmの位置でピンセットを用いて手作業で破断させます。Cに示すピペットの粗い破断面は、ギザギザしており脆弱です。

パネルDに示すように、ピペット先端を鋭くするため、ピペットを約20度傾けて面取りします。マイクロインジェクション用ピペットの抽出および面取りのパラメータは、付随するテキストに記載されています。続く2つのビデオ顕微鏡クリップでは、胚齢11.5日および12.5日のマウス耳嚢へのマイクロインジェクションを実演します。ここでの目的は、胚齢11.5日のマウス耳嚢への子宮内マイクロインジェクションを実演することです。

まず、正しく標的設定された注入がどのようになるかを明確に示すため、子宮がない状態で卵管に注入します。次に、実際の子宮経由の微量注入を実演します。この最初の注入では、内臓嚢を押し出すために子宮を完全に切開し、内臓卵黄嚢上の脱落膜帯を除去しました。

胎盤は子宮に付着したままであり、胚は生存しています。子宮を局所的に除去すると、第四脳室、主頭静脈およびその前枝と後枝、ピペット、そして白く示された嚢胞のおおよその位置が確認できます。この注入シーケンスの開始時点で、内臓卵黄嚢血管系に血流が検出されています。

ピペットを内臓卵黄嚢に通し、耳嚢（otics）にdaiを注入します。内リンパ管は背側にあり、耳嚢の位置は直立した状態の中央にあります。耳嚢は、一次頭静脈の前枝と後枝の中間に位置しています。胚齢11.5日のマウス耳嚢への子宮内マイクロインジェクションでは、耳嚢の場所を推定するために、一次頭静脈とその分枝の少なくとも1つを検出する必要があります。

この図解例におけるターゲットでは、一次頭静脈の前枝と後枝の両方が検出されており、OUC領域が白くマークされています。胚のより現実的な提示例では、一次頭静脈の主幹とともにその枝のいずれか一方のみが検出されることがあり、ここに示す例では一次頭静脈の後枝のみが見えていますが、それでも耳胞の位置を判断するには十分です。PTを子宮経由で進め、耳胞に色素を注入します。

染料が羊膜腔から排出されるまで30秒間待ちます。この時点で、背側の内リンパ管と前庭が見えてきます。最後に、解剖学的な視点を提供するため、ちょうど注入を行った胚の低倍率像を確認します。この視野では、第四脳室、左眼、および子宮血管が見られます。本動画では、胚齢12日のマウス耳嚢への移行および微小注入と、後脳の新生第四脳室への微小注入について実演します。

透照法を用いることで、この左側面像において主要な頭静脈および眼を検出することができます。ピペットを子宮経由で耳胞へと進め、管腔を満たすように色素を注入します。第四脳室に注入するために、胚を90度回転させて後脳を背面から観察します。

注入した左側の嚢胞は現在、左側に位置しています。ピペットを子宮経由で進め、fast greenとlorを混合します。結合デキストランを第四脳室に注入します。

in vivoで注入された染料の量の中脳への浸入はないことに注意してください。注入後、第四脳室におけるデキストランの局在を確認するために蛍光評価を行います。その後、胚の向きを背面から側面へと変更します。

この側面の図では、内リンパ管は第四脳室のすぐ腹側に位置しています。生体内蛍光により、デキストランが第四脳室に局在していることが確認されます。出生後、落射蛍光顕微鏡を用いて、子マウスの第四脳室に緑色蛍光が見られるかスクリーニングを行います。

胚発生期の操作（パート3：in vivo エレクトロポレーション）を受けた後後脳に緑色蛍光を持つ仔マウスを解剖顕微鏡で観察します。発現プラスミドを嚢胞に注入した後、子宮内をあらかじめ加温した乳酸リンゲル液で洗浄します。透過照明を用いることで、ODU嚢胞を電極視野の中心に合わせやすくなります。

光ファイバーライトの金属ヘッドを子宮表面から後退させます。方形波パルス列を開始する前に、次のビデオ顕微鏡クリップで、in vivoでの完全なエレクトロポレーションサイクルを実演します。胎生11.5日目のマウス耳嚢のエレクトロポレーションには、パドル型電極の子宮への慎重な配置が必要です。

この例では、左耳嚢に発現プラスミドを満たし、子宮を乳酸リンゲル液で洗浄した直後の状態である。カソードは充填された耳嚢に対して外側に配置し、アノードは内側に配置する。電気穿孔シーケンスの開始時に、耳嚢がパドル電極の視野の中心に来るように調整する。子宮を軽く圧迫し、フットペダルスイッチで矩形波パルス列を開始させる。

理想的には、1パルスあたり60から100 mAの電流を流します。その後、子宮を離し、直ちに洗浄します。洗浄したばかりの子宮を、リング鉗子で軽く押さえながら腹腔内に戻します。

子宮を体内に戻した後、腹腔内を約 4 mL の乳酸リンゲル液で洗浄します。腹腔手術直後の母動物は通常よりも飲水量が減少するため、水分保持を助けるために約 1 mL の乳酸リンゲル液を腹腔内に残しておきます。その後、ニードルドライバーを用いて、吸収性縫合糸で腹壁および皮膚を縫合します。当研究室で使用しているニードルドライバーには、縫合操作を簡便にするためのハサミが内蔵されています。

腹壁と皮膚の両方に連続縫合を用いることを推奨します。切開部位にさらなる支持を与えるため、1針おきに結節を設けて固定します。母マウスを回復用ケージに移す前に、非ステロイド性抗炎症薬を皮下投与します。

施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）が推奨する予防的鎮痛剤について、獣医スタッフに相談してください。母マウスを滅菌ドレープに包み、加温された回復ケージの底に配置します。回復ケージには、巣材、隠れ家となる赤いチューブ、実験用飼料、および給水ボトルを用意します。

手術の翌朝、ケージの上部にフィルターボンネットを取り付けて再組み立てします。親マウスは毛並みが整い、歩行可能で、開いたケージの上部を確認するように後肢でバランスを取ることができます。腹部の縫合線は清潔で乾燥しており、離開、発赤、または腫脹の兆候は見られません。

子宮内遺伝子導入のための動物ケアプロトコルの策定について論じた文書を添付しました。この文書には、動物実験委員会と相談して施設固有のプロトコルを設計する際に有用な表現が含まれています。パート4、代表的な結果。

代表的な結果を示すパネルAおよびBは、胚齢11.5日に強化緑色蛍光タンパク質発現プラスミドを耳胞に注入し、その後電気穿孔法を施行した生後6日目の幼若動物の代表的な蝸牛を示しています。蝸牛の外側壁は中回転から頂端部まで除去されました。GFPの発現は蝸牛の基底回転から中回転までのみに認められ、パネルBに示す有毛細胞マーカーであるmyosin seven Aの分布と一致しています。パネルCは、胚齢の低倍率共焦点投影図を示しています。

18.5日齢マウスのコルチ器をmyosin seven A抗体で免疫染色したもの。形質転換細胞がコルチ器全体に分布している。パネルDは、胚齢18.5日のマウスコルチ器をcin.Sevenで染色した高倍率共焦点投影像である。

GFP発現が、内耳毛細胞および外耳毛細胞、内側および外側ファランジアル細胞、ピラー細胞、およびTER細胞で検出されます。胚齢11.5日の耳嚢へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入により、コルチ器内のすべての構成細胞型に分化する前駆細胞にトランスフェクションが行われます。