ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

本手順の目的は、脳発達の出生後期間における遺伝子機能を操作することです。まず、適切なウイルスを選択および調製し、それらをシリンジに充填して注入装置を準備します。次に、新生マウスの脳にウイルスを注入し、最後に動物を安楽死させて注入領域をイメージングします。

最終的に、免疫蛍光顕微鏡法により、コントロール細胞とノックアウト細胞のラベル化の違いを示す結果を得ることができます。この手法は、出生後の発達期間がどのように遺伝的に制御されているかなど、神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。注入には、多数の細胞を操作するために、通常1 mLあたり10¹²ゲノムコピーというフルタイターの市販アデノ随伴ウイルス溶液を使用できます。

希釈が必要な場合、またはラベル付けを行いたい場合は、1/10希釈から開始します。ウイルスを氷上で解凍した後、直ちに前希釈分を滅菌済みの250 µL PCRチューブに移します。希釈液は氷上で保持してください。

適切なシリンジを選択し、それをローディングニードルに接続して注入ポンプを準備します。次に、シリンジ内にごく小さな気泡が見えるまでウイルス溶液をゆっくりと吸い上げます。この工程を容易にするために、不活性ローディングダイを使用しても構いません。その後、リテーナーでシリンジをポンプに固定します。

次に、シリンジとニードルホルダーの間に接続チューブを慎重に取り付けます。注射針がニードルホルダー内部の接続チューブに直接接触していることを確認してください。その後、針先に溶液の小さな滴が見えるまで、接続チューブを通してゆっくりと溶液を移動させます。

ポンプ上のブラケットを用いて、プッシャーブロックの隣にあるプランジャーを慎重に固定します。注入速度を 8 µL/min に設定し、注入量を 1～2 µL の間に設定します。次に、使用しているシリンジの直径に合わせて、ポンプのシリンジ直径設定を調整します。

最後に、回復期の仔マウスを保護するため、ホットプレートを38 °Cに設定し、ペーパータオルで覆います。IACUC承認済みのプロトコルに従い、冷麻酔を用いてP0またはP1のマウス仔を注射の準備状態にします。数枚のペーパータオルを水で湿らせ、氷の上に置きます。

次に、4～5匹の子マウスをペーパータオルの上に十分な間隔をあけて置きます。ペーパータオルを子マウスに被せるように折りたたみ、その上に少量の砕氷を静かに置き、約5分間インキュベートします。子マウスは最長15分間まで氷上で安全に保持することができ、その後も良好に回復します。

次に、注射部位に最もアクセスしやすいように、麻酔をかけた幼若マウスを固定台に配置します。例えば、皮質にアクセスする場合、動物を腹向きに平らに寝かせるのが最も簡単です。絆創膏を使用して幼若マウスを固定し、頭部を手で安定させ、皮膚を強く引っ張って動かないようにします。

次に、ラムダ縫合などの頭蓋骨の解剖学的指標を確認し、もう一方の手で再現性のある注入部位を選択し、針を頭蓋骨にゆっくりと刺入します。針が容易に頭蓋骨を貫通しない場合は、強く押し込まないでください。代わりに、針の位置を調整して、再びゆっくりと試行してください。

皮質への注入深さは、個体や系統によってわずかに異なりますが、通常は0.5〜1 mmの深さで問題ありません。次に、手の動きを最小限に抑えるため、同僚にポンプを操作してもらいながらウイルス溶液を注入します。理想的には、注入後にフットペダルを使用してポンプを始動させることが可能です。

針を数秒間そのまま保持し、その後、仔犬の頭部を静止させた状態で、針をスムーズに抜き出します。次に、カバーをしたホットプレートの上で、仔犬を5～10分間回復させます。

この間に、他の仔マウスへの注射を続けてください。すべての仔マウスがピンク色に戻り、動き始めたら、元のケージの敷材の一部で優しく体を拭ってください。その後、母親の元に戻すことができます。

そうでない場合、それらは見知らぬ仔として扱われ、母親に返された後に殺される可能性が高くなります。注射装置は、アセトンまたは70%ethanolをシリンジに満たして洗浄してください。sanoやacurate、接着剤などのアセトンに敏感な構成部品を使用している場合は、新しい溶液を用いて注射装置内を数回洗浄してください。

これにより、残っているウイルス溶液と沈殿物が除去され、溶媒が蒸発します。セットアップを洗浄した後、次の方の実験準備を整えるため、漂白剤で作業エリアを消毒してください。この手法を適切に行うことで、注入部位において強固なニューロン感染が誘導されます。

皮質や上丘などの特定領域への注入では、通常、隣接領域への広がりを最小限に抑えた局所的な感染が誘導されます。高タイターのウイルス溶液を使用すると、海馬などの隣接領域への感染が起こりやすくなります。一方、低タイターのウイルス溶液を注入した場合は、正中線付近への小脳注入のように、通常は注入部位付近でまばらな感染となります。感染細胞数は、注入したウイルス溶液のタイターと相関するはずです。

例えば、異なる蛍光タンパク質を発現する2種類の高タイターR AAV8ウイルス溶液を小脳に注入すると、異なるラベルが付いた多くのPurkinje細胞に感染します。逆に、低タイターのウイルス溶液を注入することで、単一細胞の可視化に役立つ疎な感染をさせることができます。蛍光ラベルされたニューロンは、新鮮な切片生組織で直接観察することも、免疫染色を行うことも可能です。

これにより、広視野または共焦点蛍光顕微鏡による後の画像取得において、内在性の蛍光シグナルが増強されます。最後に、RAAV eightは皮質のさまざまな種類のニューロンに感染させることができ、微細な突起を強力に標識することが可能です。この手法に習熟し、適切に実施すれば、約30分で完了させることができます。