ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

本手順の全体的な目的は、簡便なプロトコルを用いてポリオウイルス分離株を迅速に特定することです。このアッセイでは、ヒトポリオウイルス受容体の細胞外ドメインとIgG 2 fcを結合させたキメラ分子でコーティングした感作ゼラチン粒子を使用します。これらの粒子は、ポリオウイルス分離株のすべての血清型に対して均一な親和性を持つため、ヒトポリオウイルスを含むサンプルとインキュベートすると粒子の凝集が起こります。

しかしながら、サンプルから分離された特定のウイルスを認識できる抗体が存在する場合、中和が起こり凝集が妨げられます。この実験系を用いることで、ポリオウイルスの分離株を一段階の反応で迅速に同定することが可能です。従来の中和試験などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、手順と判定が非常に簡便であることであり、労力の削減と迅速化を図り、結果を得るまでの時間を短縮することを目的としています。anti PV one、PV two、およびPV three抗体を復元するには、各バイアルに0.5 millilitersの水を加えます。

次に、各抗体溶液を、4.5 millilitersの維持培地を含む別々のチューブに分注します。抗PV抗体の中には、あらかじめ復元された状態で提供されるロットがあります。そのような抗PV抗体ロットについては、復元のための水の添加は不要です。

次に、新しいラベル付きチューブに、最終容量が3.6 millilitersとなるように抗体溶液を1対1で混合して調製します。例えば、anti PV oneを1.8 millilitersとanti PV twoを1.8 milliliters混ぜ合わせます。anti PV oneとPV twoの組み合わせを調製するため、考えられるすべてのペアの組み合わせについてこれを繰り返し、さらに各抗血清を1.2 millilitersずつ混ぜ合わせることで、3種類すべての抗体を含む溶液を調製します。

4つの混合物の調製が完了したら、各抗体溶液に720 µLのFCSを添加します。これにより、アッセイ中の抗体によるゼラチン粒子の非特異的凝集を抑制できます。抗体プールは、凝集アッセイで使用するまで-20 °Cで保存可能です。

本アッセイでは、ヒトポリオウイルス受容体の細胞外ドメインおよびマウスFCドメインに対するIgG2でコーティングされた凍結乾燥ゼラチン粒子を使用します。凝集像の一貫性を確保するため、1回の実験で異なるロットの粒子を混ぜず、必ず単一ロットの粒子を使用してください。各バイアルに1.5 mLの再構成バッファーを加えて粒子を再構成します。軽く叩いてよく混ぜ合わせてください。

再構成した粒子は、4 °Cで最大2週間保存できます。まず、96ウェルマイクロタイタープレートを用いて実験を設計してください。各サンプルについて、ウェル1にはウイルスのみを分注します。

ウェル2から5には、ウイルスと4種類の混合抗体溶液のいずれかを添加します。ウイルスおよび抗体を含まず、培地のみを添加した陰性対照用にウェルを1つ確保してください。プレートの準備が完了したら、2行目から5行目の各ウェルに、適切な抗体溶液を12 µLと、増殖培地を12 µLずつ添加します。

1行目のウェルにはウイルスのみを含む培地を、6行目の陰性対照ウェルには培地を添加します。次に、1〜5行目のウェルにウイルスサンプルを12 µLずつ、6行目の陰性対照ウェルに増殖培地を12 µL添加します。抗体とウイルスをプレートに分注した後、軽く叩いて再構成されたゼラチン粒子を懸濁させ、直ちにすべてのウェルに粒子を25 µLずつ添加します。

各ウェルに等量の粒子を分注するためには、プレートに移す前に粒子を沈殿させないことが重要です。アッセイプレートをプレートミキサーにセットし、30秒間混合します。その後、プレートを白い紙の上に置き、室温で2時間インキュベートして凝集反応を進行させます。

凝集形成物は不安定であるため、インキュベーション中およびインキュベーション後はいかなる時もプレートを動かさないことが重要です。反応が起こった後、各ウェルの凝集の質を確認できるよう、プレートの写真を数枚撮影します。凝集が起こらなかったウェルでは、こちら左側に示されているように、着色ゼラチン粒子がウェルの底に沈殿します。凝集が起こったウェルでは（凝集が見られます）。

ウイルスとpvr、およびIgG two Aコートゼラチン粒子の相互作用により、中央に示されているように拡散した色パターンが観察されます。本実験では、抗体存在下でウイルス溶液（PV one、two、three）が凝集を誘導する能力を検証しました。ここに示す組み合わせにおいて、ウイルスまたは抗体が存在しない場合は凝集が起こらず、ゼラチン粒子が沈殿します。これに対し、ウイルスは含まれているが抗体が含まれていないウェルでは、対照的な結果となります。

ウイルスの相互作用により凝集が起こっています。実験ウェル内のPVR IgG 2A被覆ゼラチン粒子において、そのウイルスを特異的に中和する抗体が含まれているウェルでは、ウイルスの凝集が阻止されます。例えば、ポリオウイルス1型の凝集は、抗PV1抗体を含むウェルでは阻止されますが、抗PV2抗体および抗PV3抗体のみを含むウェルでは阻止されません。

ポリオウイルス2型および3型についても同様です。この手法に習熟すれば、適切に実施することで最短3時間で完了させることができます。