嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで

神経科学における発達研究の課題の一つは、生体内で単一細胞レベルでの樹状突起および軸索の形態を捉えることです。嗅覚系において、嗅覚感覚ニューロンは鼻の嗅上皮から脳の嗅球に向かって軸索を伸展させます。複数の嗅覚感覚ニューロンが嗅球に向かって投射するため、それらは束となってまとまります。

これにより、個々の軸索の走行およびその終末形態の研究が困難になります。私たちは、GFP構築物を搭載したレンチウイルスを微量注入することで、嗅覚感覚神経細胞をin vivoで可視化する方法を開発しました。

レンチウイルスを用いた形質導入に成功すると、末端樹状突起を含む嗅覚感覚軸索の全長が可視化されます。この手法は、単一の嗅覚感覚ニューロンを視覚化できるだけでなく、特定の目的遺伝子の発現を操作することで、生体内（in vivo）におけるその機能を解析することを可能にします。このレンチウイルスを用いた手順はバイオセーフティーレベル2に該当し、層流クリーンベンチ内で行う必要があります。

無菌状態を維持するため、フード内に導入するすべての物品に70% ethanolを噴霧してください。また、注入前に、37°Cの水槽を準備し、少なくとも20分間予熱しておきます。水を入れたプラスチック製保存袋を半分まで満たして密閉し、空のヒーティングブロックインキュベーター上に設置してください。

これにより、マウスは注射後に回復することができます。すべてのウイルス曝露物を除染するため、バイオハザード廃棄物容器に10% bleachを充填します。この手順に備えて、70% ethanolを入れた小さなオープンディッシュと、滅菌蒸留水を入れた2つ目のディッシュを用意します。

ラミナーフローフード内で、33ゲージの針を備えた容量5 µLのハミルトンシリンジを使用します。この特定のモデルでは、プランジャーチャンバー上部にあるテンションダイヤルを回すことで、プランジャーの抵抗を調整できます。この機能により、針とシリンジチャンバーを滅菌するためのマイクロインジェクション注入量の制御が可能になります。

ディッシュ内のエタノールを、シリンジで繰り返し吸引および排出します。その後、滅菌水を数回吸引および排出して、シリンジカートリッジを洗浄します。シリンジはフローフード内の安全な場所に置いてください。

注射ステーションの近くにアルコール綿を配置します。マウスの固定を容易にするため、表面が高くなっている注射台を準備します。10 cmの培養皿を逆さまにし、Kimwipeで覆ったものを使用できます。

マウスの幼仔は、離乳期まで低体温による麻酔が可能です。ゴム手袋の指部分を切り取り、そこにマウス幼仔を入れます。その後、氷の上に5分間置きます。

手袋を着用することで、氷による皮膚への直接接触で起こりうる凍傷を防ぎます。仔マウスの後肢と前肢をピンチして動物が反応しないことを確認し、十分に麻酔がかかっているかを確認します。これでレンチウイルスのマイクロインジェクションの準備が整いました。ここでは新生仔マウスを用いて実演します。

より高齢のマウスを使用する場合は、頭蓋骨表面を貫通させるために、33ゲージの針をより太いゲージの針に変更してください。アルコール綿でマウスの鼻表面を拭き、滅菌します。冷凍保存していたレンチウイルスストックを取り出し、氷上で解凍します。

確立された手法を用いて、研究室内でレンチウイルスを作製しました。本手法の開発において、良好な導入率を得るには10⁹ infectious units/mL以上の最小ウイルスタイターが必要であることが分かりました。滅菌済みのハミルトンシリンジを用いて、レンチウイルスストック溶液を2 µL吸引します。

マウスの幼仔を注入ステージの上に置きます。耳のあたりの頭頂部の皮膚をつかみ、ゆっくりと後方に引きます。なお、本施設ではフローフードに解剖顕微鏡を設置しています。

マイクロインジェクションを正確に行うために、前脳の頭蓋骨背面を探索し、嗅球の輪郭を確認します。マイクロインジェクションの標的部位は嗅球のすぐ周囲に設定しますが、嗅球自体には注入しないようにしてください。各幼仔の嗅上皮に4回の注入を行います。

青色の点で示されたこれらの部位では、針を内側に向かう角度で刺入する必要があります。緑色の点で示されたさらに2か所の注入部位は、嗅球よりもさらに内側かつ前方にずらして配置されています。これらの注入は、互い違いに角度をつけて行うことができます。

針の角度に関する提案は、嗅上皮が主に嗅球の下方に位置する腹側配置であることを考慮してなされています。そのため、垂直方向からのアプローチは制限されます。皮膚表面から約3 mm下の鼻腔上部から針を刺入してください。

嗅覚上皮に到達させるため。習熟した操作者が、鼻腔の腔内空間に達した際に抵抗が減少する感覚を確認する必要があります。この領域は避けてください。

1箇所あたり0.5 µLのウイルスストック溶液をマイクロインジェクションします。左右それぞれ2箇所ずつ、計4箇所に0.5 µLずつ注入します。つまり、1回の注入セッションにつき、マウス1匹あたり合計2 µLのウイルスが必要となります。

ここでも、嗅球への注入時に、注入部位や鼻孔から漏れ出した残留ウイルス溶液や血液を拭き取らないよう注意してください。エタノールワイプを使用して拭き取り、使用済みのワイプは希釈次亜塩素酸ナトリウム液の容器に廃棄し、注入後のマウスを直ちにウォーターベッドインキュベーターに置いて回復させてください。準備時に行った滅菌手順を繰り返し、注射針とシリンジを除染します。注入したマウスは、ウォーターベッドインキュベーターでの回復から30分後にケージに戻すことができます。

このマイクロインジェクションの一連の操作は、4時間後に再び繰り返すことができます。感染させる嗅覚神経細胞の数を増やしたい場合、感染した嗅覚神経細胞は最短3日で細胞全体にわたって可視化されます。その後、希望するタイムポイントで動物を安楽死させ、灌流固定して観察を行います。

導入された単一細胞嗅覚感覚ニューロンの軌跡および軸索末端を可視化するため、標準的な手法を用いて、嗅球を冠状面に60 µmの厚さで切片化します。これにより、嗅球のすべての細胞層、すなわち嗅覚感覚ニューロンの軸索束および、嗅球表面の糸球体構造内でシナプスを形成する軸索末端を含む切片が得られ、浮遊免疫組織化学染色の準備が整います。嗅球の連続切片を作成し、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水が入った10 cmの培養皿にまとめて回収します。

浮遊している切片を50 mLのコニカルチューブに移します。切片がチューブの底に沈殿したら、リン酸緩衝生理食塩水を吸引除去します。この際、切片まで吸引しないよう注意してください。

切片に10 millilitersの新鮮なバッファーを加え、残留している固定液や包埋剤を洗い流します。この再懸濁液を直ちに15 milliliterのコニカルチューブにピペットで移し、浮遊しているすべての切片を回収してください。洗浄液を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水に0.3%Triton X 100を溶解した溶液で切片を透過処理し、ロッカープラットフォーム上で10分間静置します。室温にて、そのまま同一のコニカルチューブを用いて標準的な免疫染色プロトコルに進みます。このサイズの容器に合わせて、必要に応じて吸引とロッキングの工程を繰り返してください。なお、染色および洗浄ステップ用に10 milliliterの容量を確保してください。

以下は、陽性に導入された嗅球感覚ニューロンおよび嗅球感覚ニューロン集団全体を共染色するために使用する抗体リストです。60 µmの嗅球切片に抗体を十分に浸透させるため、4 °Cで一晩インキュベートすることを推奨します。また、各洗浄ステップは20分以上行う必要があります。

各切片を筆を用いてガラススライド上に静かに広げ、クロマチン染色溶液を添加したflora Mount Gを用いて封入します。封入剤からすべての気泡を取り除くようにしてください。後のスクリーニング工程を簡略化するため、切片を列状に配置して封入します。

免疫染色を施した球部切片のこれらの層をスキャンし、GFP陽性の軸索線維および末端を確認します。蛍光顕微鏡を用い、感染した神経末端を共焦点顕微鏡でイメージングします。DPIおよび嗅球マーカータンパク質（OMP）チャネルを用いて、関心領域の焦点面を調整すると効率的です。

これらの結果は、糸球体内の単一の嗅覚感覚ニューロン軸索線維および軸索末端を示しています。赤色は嗅覚マーカータンパク質で染色されたCOであり、灰色はvlu twoに感染した嗅覚感覚ニューロンの細胞体です。また、組織の解剖および免疫染色のステップに嗅上皮が含まれていれば、その樹状突起のノブも可視化することができます。この共焦点投影画像により、単一の嗅覚感覚ニューロンの軸索伸展経路と末端の樹状分枝の非常に詳細な形態を確認することが可能です。軸索線維が標的となる糸球体に向かって戻る様子や、糸球体ニューロピル内での分枝パターンの詳細が見て取れます。

レンチウイルスマイクロインジェクション法を用いることで、嗅覚感覚ニューロンの単一細胞軸索や形態の可視化が可能となり、遺伝子発現を操作する研究が行えます。レンチウイルスの導入は、コンストラクトの安定したゲノム組み込みをもたらします。レンチウイルスはシナプスを介して隣接する細胞に感染することはありません。可視化は最短3日で達成でき、少なくとも3か月間持続することが確認されており、おそらくそれ以上の期間持続すると考えられます。

嗅覚感覚ニューロンは、レンチウイルス溶液の鼻腔内注入では容易に感染しません。そのため、本手順では表面からのマイクロインジェクションが必要です。以上がレンチウイルスのマイクロインジェクションの手順となります。

これらの情報が、皆様自身の単一細胞形態の取得に役立つことを願っております。それでは、研究に励んでください。