使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

本手順の全体的な目的は、胚性中枢神経系のニューロンにおける遺伝子発現を改変することです。まず、タイミングを合わせた妊娠雌個体を入手し、手術の準備を行います。その後、腹部切開を行い、子宮角を露出させます。

胚を露出させた後、DNAを側脳室、第三脳室、または網膜下腔に注入します。手順の最終ステップとして、子宮壁を通じて胚に電流を流します。この際、パドル電極を調整し、陽極が目的のトランスフェクション部位の上に位置するように配置します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、tline kelon dying kelonおよび網膜における神経前駆細胞の増殖、遊走、および分化を示す結果を得ることができます。

この手法の、トランスジェニックマウスの作製などの既存の方法に対する主な利点は、迅速であり、よりハイスループットな研究が可能で、コストを低く抑えられることです。この方法は、どの遺伝子が神経前駆細胞、細胞増殖、細胞運命決定、ニューロン分化、および細胞遊走を制御しているかといった、神経発達分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の意義は、中枢神経系（CNS）の発達不全の根底にある遺伝的経路のより深い理解へと広がる可能性があり、その多くはヒトにおける認知機能障害や行動障害を引き起こします。これは、中枢神経系の発達を理解する上での有用性にとどまらず、さらなる応用が期待されます。

この手法は、発達中の末梢神経系、心臓、胎盤などの他の器官系にも適用できます。また、マウスの疾患モデルだけでなく、ニワトリやゼブラフィッシュ（xip）などの他のモデル生物を用いた研究にも適用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方にとって最大の課題は胚の生存率であり、胚の操作、注射、および注ぎ込みの際には細心の注意を払う必要があります。

私たちは、胚、終脳および網膜において遺伝子発現を操作するための迅速な手段を必要とした際に、まずこの手法を考案しました。私たちは、2001年にDevelopmental Biology誌で発表されたSalによる当初の手法を改変し、自らの研究室でこの技術を開発しました。また、共同研究室と協力し、発生過程にあるdilonにおいてもこのプロトコルを確立させました。

注入およびエレクトロポレーションの工程は、胚の非常に慎重な操作が必要であり、注入部位が極めて小さい場合があるため、習得が困難です。そのため、本手法の視覚的な実演が不可欠となります。例えば、網膜下腔などが挙げられます。本日は、Sherman研究室のポストドクであるRajivが手順を実演します。まず、すべての手術器具を洗浄し、滅菌します。次に、シリンジに生理食塩水および乳酸リンガー液を満たし、手術エリア内のヒータパッドの上に置いて加温します。

ヒーティングパッドを70% ethanolで滅菌し、滅菌済みの Lint-free ガーゼパッドで覆います。ヒーティングパッドを37 °Cに設定します。動物を小型の麻酔チャンバーに入れ、気化器を用いて酸素 1 L/min の流量で 5% isof fluorine を投与し、麻酔をかけます。

イソフルランの排気は必ず回収システムを用いて回収してください。動物の呼吸が深く安定したことを確認後、チャンバーから取り出します。つま先への刺激（toe pinching）および眼瞼反射（eye blink reflexes）を用いて確認してください。

完全な麻酔状態を確保するため、麻酔をかけた動物を腹臥位に置き、手術中は呼吸器チューブを用いて2.25%のアイソフルランを投与します。また、ブプレノルフィンを体重1kgあたり0.1mgの濃度で、首の後ろに皮下注射します。

動物の呼吸を継続的にモニタリングし、必要に応じてイソフルランの流量を調整します。次に、麻酔下にある動物の胸部をテープで固定し、鈍端鉗子で後肢をつまんで後退反応を再度確認します。滅菌綿棒を用い、腹部の下毛が完全に覆われるように、デクリームを厚く塗布します。

クリームを約3分間塗布し、脱毛状況を断続的に確認します。滅菌綿棒を使用し、滅菌ガーゼパッドを滅菌水で湿らせて、腹部の毛を拭き取ります。次に、クロルヘキシジンとさらに水を用いて、切開部位を滅菌します。

清潔な滅菌ガーゼで腹部を拭き取ります。新しい滅菌綿ガーゼを用いて、70% ethanolでこの操作を繰り返します。子宮角を露出させるため、手術着を着用し手術の準備をします。

まず、正中線上の皮膚の下にあるかすかな線として白線を特定します。ピンセットで皮膚を腹壁から引き離し、曲面ピンセットと皮膚用はさみを使用して、腹部中央から下方に向かって小さな直線的な切開を入れます。腹膜に対しても同様の手順を繰り返します。ピンセットで腹膜を把持します。

牽引して、子宮を抽出できる十分な大きさの切開を加えます。小さな垂直のスリットを入れた滅菌ガーゼを切開部に当て、温かい滅菌生理食塩水で湿らせます。次に、鉗子を切開部に挿入して子宮を特定し、鉗子で切開部を開いたまま保持します。

最初と2番目に見える胚の間で子宮を把握し、子宮角の両端をガーゼの上に引き出します。胚の数を数え、吸収胚や体サイズの小さい胚がないかを確認します。適切な数のDNA注入を準備するため、子宮角を生理食塩水で湿らせ、片方の子宮角を慎重に腹腔内に戻します。

サージカルニードルに充填するために、口ピース付きのパステールピペットを用いて、メチルグリーン染料を含む3 mg/mLのエンドトキシンフリーDNA溶液を10 µL吸引し、サージカルニードル内に分注します。充填した最初のニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けます。

卵巣に最も近い胚から始めて、インジェクターを固定します。円形鉗子を用いて、胚を脱落膜内で慎重に回転させ、正面を向くように配置し、ROSロールから臍帯方向への注入を可能にします。光ファイバー光源を使用して、胚の脳の中心線を特定します。

吻側領域にある左右に並んだ拡大した側脳室を確認します。湾曲鑷子を用いて胚を固定し、脳への進入角度が約45度になるように、充填済みの手術用針を子宮の上に配置します。素早く正確な動作でマイクロマニピュレーターのダイヤルを回し、針先を子宮壁から胚の脳の側脳室へと挿入します。

次に、マイクロインジェクターのフットパッドを押します。DNA溶液を注入します。メチルグリーン染料が胚の脳室全体に広がることで、注入が成功したことを容易に確認できます。DNAの注入が完了したら、針をゆっくりと引き上げ、破損させないように抜去します。

注入済みの胚を滅菌ガーゼの上に置き、温 saline で十分に濡らします。導入させたい部位にパドル電極の陽極を当てて子宮を挟みます。その後、40～50 V、50 ms の矩形電気パルスを、1秒間に1パルスの割合で5回印加します。

注入および電気穿孔を行った胚を保護用の濡れガーゼで覆い、次の胚の注入へと移ります。子宮角内の目的とするすべての胚への注入と電気穿孔が完了したら、慎重に体腔内に戻します。2つ目の子宮角を取り出し、残りの胚の注入および電気穿孔を開始します。

すべての胚を子宮内に戻した後、腹腔内に2〜3 mLの温 saline を注入し、腹部のガーゼを取り除いて腹膜の側面を露出させます。黒色の編組絹糸を用いて、胸骨に最も近い腹膜に糸を固定し、そこから離れる方向に縫合して腹膜を閉じます。すべての縫合がしっかりと締まっており、腹膜の下にある臓器や皮膚が一緒に縫い込まれていないことを確認してください。

残りの縫合糸を切り、廃棄します。皮膚閉鎖用ステープラーを用いて、鉗子で縫合線上の皮膚を引き寄せます。下の縫合線までステープルを打ったり、皮膚を強く引っ張りすぎたりしないように注意しながら、皮膚を固定します。

完了後、ここにある縫合ツールで軽く押し合わせ、ステープルがしっかりと固定されていることを確認します。GFPの発現を誘導する2つの発現ベクターA-P-C-I-Gを、胎生12日目（E 12）の発達中の新皮質にエレクトロポレーションしました。新皮質の発達が進むにつれて、頂端前駆細胞は二次基底前駆細胞または分化後のニューロンに分化し、GFPを発現し続けます。これにより、これらの神経細胞において、赤色で示されている神経サブタイプの典型的なマーカーの発現を解析することが可能です。

E 12にエレクトロポレーションを行い、E 14に解剖した胚の前脳の腹側像において、エレクトロポレーション部位はE 14時点での緑色のエピ蛍光によって示されています。GFPの発現が視床、視前視床、および視床下部で認められ、目的の領域が正常にトランスフェクションされたことがわかります。破線枠は、脳室帯を通る切断部位を示しています。

脳室帯を詳しく観察すると、GFP陽性細胞が脳室帯から外套帯へと移動していることがわかります。視床下部核が形成される部位や胚性網膜においても、E 15.5でPCICを用いてエレクトロポレーションを行ったE 16.5胚のこの冠状切片に示されているように、容易にエレクトロポレーションが可能です。ここでは、mCherry陽性細胞の蓄積は外神経芽細胞層に特異的であり、神経節細胞層にあるBrn3b陽性の網膜神経節細胞では見られません。この技術を習得すれば、予期せぬトラブルがなければ30分で完了させることができます。

本手順を行う際は、適切な無菌操作を徹底し、胚を操作する際は手を震わせないようにすることが重要です。また、妊娠した雌マウスに麻酔をかける前に、必要な資材をすべて準備しておいてください。本手順の後、電気穿孔（エレクトロポレーション）した胚を成体まで成長させることができ、その時点で行動解析や機能解析などの他の手法を用いて、胚期における特定の遺伝子の操作が成体の神経機能にどのような影響を与えるかという追加の疑問を検証することが可能です。本手法の開発以来、中枢神経系（CNS）発達分野の研究者が、マウスの生体内で遺伝子機能を探索するための道が開かれました。

このビデオを視聴することで、胚の神経管に外来DNAを導入する方法を十分に理解することができます。具体的には、手術に向けた妊娠雌の準備方法、子宮の露出、DNAの注入、および胚への電気穿孔法（エレクトロポレーション）の手順について解説します。

イソフルオリンの使用は危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中はスカベンジングシステムなどの予防策を講じることを忘れないでください。