マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発子宮内エレクトロポレーション

この手順の全体的な目標は、子宮内で発生しているマウス胚の視床下部に血漿DNAをトランスフェクションして、目的の遺伝子の機能を活性化または抑制することです。これは、最初に妊娠中のマウスに麻酔をかけ、開腹術を通じて子宮を露出させることによって達成されます。2番目のステップは、DNA溶液を胚脳の第3脳室に注入することです。

次に、正極は胎盤と胚頭部の間の子宮内に配置されます。負極を子宮外表面に配置し、電気パルスを印加します。最後のステップは、トランスフェクションされた胚の脳を6日後に除去することです。

最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、トランスフェクションされた細胞の数、形状、位置、マーカー発現などの表現型の変化を分析します。ウイルストランスフェクションのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、第一に、特別な予防措置を必要としないこと、そして2つの施設として、特定の領域を第二に標的とすることが可能であることです。そして第三に、Uteエレクトロポレーションにより、候補遺伝子のスクリーニングが迅速になります。

一般に、この方法に不慣れな人は、DNA溶液を第3脳室に注入し、針電極を適切に配置するには、高度な手動スキューとある程度の経験が必要なため、苦労するでしょう。この方法は、視床下部発生の分野、特に細胞遊走に関連する問題や、個々の領域と核が遺伝的にどのように特定されるかについての質問に答えるのに役立ちます。羊水の損失による初期の高い流産率を減らすために不可欠であるため、いくつかの良質のガラスマイクロピペットを引っ張ることからこの手順を開始します。

DNAを調製するには、精製されたエンドトキシンフリー血漿DNAを0.1%のファストグリーンを含むPBSに溶解し、1マイクロリットルあたり1〜2マイクログラムの最終濃度にします。ファストグリーンは、注入された溶液を胚の脳室で見えるようにします。次に、10マイクロリットルのDNA溶液をガラスマイクロピペットにロードします。

次に、ガラスマイクロピペットを注入システムまたはマウスピペットに接続します。このステップでは、加熱パッドと手術器具で手術台を準備します 冷たい光源をオンにして、胚の視覚化を容易にします。次に、ガラスビーズ滅菌器を使用して手術器具を消毒します。

次に、妊娠中のマウスにイソフッ素で麻酔をかけます。マウスに麻酔をかけた後、乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。その後、マスクを顔に取り付けて、麻酔を継続的に維持します。

次に、マウスを腹を上にして加熱パッドに置きます。四肢をテープで固定して体を固定します。マウスの尻尾をつまんで逆流症にすることで、マウスが完全に麻酔されていることを確認してください。

その後、腹部の表面を剃り、ヨウ素溶液で消毒します。腹部の皮膚に約1〜1.5センチメートルの長さの縦方向に切開します。その後、腹膜を切断します。

次に、切開部の周りに綿ガーゼを置きます。ガーゼをPBSですすいでください。鈍い鉗子で慎重に引き抜くことにより、1つの子宮角を露出させます。

子宮筋層や子宮をしっかりと引っ張ることは避けてください。子宮内の高圧は、注射時に胚体液が失われる可能性が高くなり、流産につながるためです。次に、子宮角をPBSですすぎたガーゼに置き、数分ごとにPBSですすいで湿らせます。

次に、顕微鏡で、脳室を視覚化できるように子宮を保持します。好ましくない位置にある胚を広範囲に再配置しないでください。これでは、中絶の可能性が高まるだけです。

胚の頭を上から見て、左右の皮質半球の間に亀裂が開いている隙間を見つけます。半球は区別しやすく、その中の側脳室は通常、やや暗い形状として認識できます。胚がDNA注入に対して完全に向き合っていることがわかれば、子宮壁を突き刺して一度に第三脳室に入ることが可能です。

以前に調製したDNAを子宮壁に対して45度で保持し、半球間裂の吻側端で穿刺し、約1ミリメートルの深さまで貫通させます。このようにして、ガラスマイクロピペットの先端は、側脳室ではなく、脳の第3脳室に入ります。ワードが第3の心室にDNAの解決の言葉の1マイクロリットルを注入した後、緑の液体はよい注入の心室を、同じ子宮の角のすべての胚と同じプロシージャを繰り返します。

これにより、DNA溶液が心室液と均一に混ざり合い、神経上皮全体に到達するまでしばらく時間がかかります。次に、エレクトロピーターをオンにし、胚の年齢に応じて設定を調整します。ステンレス鋼の針電極を正極、丸いフラット電極を負極として使用し、背側を上にしてエレクトロポレーション用の胚を選択します。

次に、羊水嚢と胎盤の間の胚の頭の隣の子宮壁を、針電極の先端を下向きに突き刺して突き刺します。次に、もう一方の手の人差し指をスラストブロックとして使用します。電極先端の約5ミリメートルは、中脳のほぼレベルで羊膜嚢と子宮壁の間にある必要があります。

これは標的電極であるため、その位置によって視床下部神経上皮のどの部分がトランスフェクトされる可能性が最も高いかが決まります。次に、もう一方の手で丸い平らな電極を子宮壁の外側、胚の頭の反対側に配置します。次に、電極の間に胚をそっと押します。

ペダルスイッチを使用してvolを適用しますtage.その後、もう一方の手の人差し指で子宮を押さえながら、針電極をゆっくりと子宮から引き出します。羊水が穿刺された壁を通して失われると、通常、胚は流産を受けます。

すべての胚の注入とエレクトロポレーションの後、子宮をマウスの腹部に非常に慎重に戻し、以前とまったく同じように配置してください。次に、腹膜腔を閉じる前に生理食塩水で腹腔を湿らせます。手術用の猫の腸で腹膜を縫合し、次により抵抗力のある縫合糸で皮膚を縫合します。

腹部表面をヨウ素溶液で消毒し、痛みを和らげるために非ステロイド系抗炎症剤を皮下に注射します。次に、母親を麻酔器から取り出し、温熱パッドで加熱するケージに入れます。マウスが麻酔から完全に回復するまでマウスを監視し、毎日チェックして、感染や痛みの兆候なしに処置から回復していることを確認します。

このステップでは、分析の希望の日に従って胚または出生後に収穫します。DNAを注入してエレクトロポレーションした胚を選択し、この実体顕微鏡で脳を解剖します。次に、適切な領域で緑色蛍光シグナルを確認します。

選択した胚の脳を解析するには、組織を4%パラアルデヒドに短時間固定します。次に、aros 4%またはゼラチンアルブミンに埋め込みます。次に、ビブラートで脳を切片にします。

これらの図は、E 12.5で蛍光レポーター遺伝子、GFPまたはCFPを運ぶ血漿DNAの子宮内トランスフェクション後の視床下部を示しています。これは、吻側から抱きかかえにトランスフェクションされた視床下部を示す矢状切片であり、これは、メディア側軸に沿って異なるレベルで標識された細胞の横断面です。この矢状切片は、特異的にトランスフェクトされた乳頭体とその特徴的な軸索樹の標識を示しており、この横断断面のエレクトロパレード側には、E 12.5で生まれたニューロンに対応する標識バンドが示されています。

セクションをより詳細に分析します。乳頭陥凹から発せられる放射状グリア突起の平面に平行な水平断面を調製した。E 12.5日目にトランスフェクションされた神経上皮から生まれたambi Oニューロンは、GFPに対する抗体によってE 18.5日目に同定されました。

この例では、抗体はMBO細胞の制限されたグループを標識しました。このグループは、E 12.5の前後に生まれたMBOニューロンに対応する2つの非標識側方および内側MBO領域と、ネストンに対する抗体による共染色の間に位置していました。赤は、神経上皮の放射状グリアプロセス上の個別に標識されたニューロンの移動モードを示しています 一度習得すると、この手法は適切に実行されれば30分で実行できます。

このビデオを見た後、DNAを第3脳室に注入する方法と、視床下部を効率的に標的にするために、胚、頭部、胎盤の間の正極として針を配置する方法についてよく理解できるはずです。この手順に従います。免疫組織化学やイニドハイブリダイゼーションなどの他の方法を実行して、トランスフェクションされたニューロンの表現型に関する追加の質問に答えることができます。