レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

この手順の全体的な目的は、抑制性ニューロン回路の局所的な機能的組織を調査することです。まず、マウスの一次体性感覚野から生体脳切片を作製します。次に、脳切片内の標的となるGFP発現抑制性細胞種の可視化および記録を行います。

グルタミン酸を介したこのレーザースキャン光刺激に続き、アンケイジングを用いて、興奮性または抑制性として前シナプスニューロンの小さなクラスターを活性化させます。次に、GFP発現インターニューロンにおいて後シナプス電流を記録します。最終ステップとして、光刺激とデータ解析を行い、記録したニューロンへのシナプス入力の定量マップを作成します。

最終的に、レーザースキャン光刺激とホールセル記録を組み合わせることで、特定のタイプの抑制性ニューロンへのシナプス入力の詳細なマップを構築することが可能となり、これにより局所的な皮質抑制性回路の構成と機能を明らかにできる可能性があります。この光刺激に基づく手法は、Larry Katz博士とNed Calloway博士によって先駆的に導入され、その後、私の指導教官であるCarols Waboda博士と、Salk研究所でCalloway博士のもとでトレーニングを受け、インターニューロン回路に関する多くの研究を主導したXing Z博士によってさらに発展させられました。私たちのグループは現在、これらの研究を拡張・継続し、インターニューロン回路の調査を行っています。

この手順を開始するには、生後2〜3週目のトランスジェニックマウスを斬首して安楽死させ、速やかに脳を取り出し、凍結させた酸素供給済みの切片作成用溶液に入れます。次に、GFPゴーグルを用いて脳を視覚的にスクリーニングし、GFPの発現を確認します。続いて、バイブレーターを用いて一次体性感覚野を厚さ400 µmの切片にスライスします。

95%O2および5%CO2をバブリングしたスクロース含有A CSF中で、スライスを32 °Cで30分から1時間インキュベートします。その後、スライスを室温の通常のA CSFに移し、実験に向けてレーザーの準備を行い、レーザー冷却システムと電源をオンにします。次に、スキャニングミラーシステム、光学モジュレーター、電子シャッター、およびフォトダイオード入力アンプを含む、光刺激制御に関連するすべてのハードウェアをオンにします。

次に、Multi Clamp 700Bアンプやマイクロマニピュレーターなどの電気生理学装置の電源を入れます。電気生理学的記録、光刺激、およびイメージングは、顕微鏡の電動ステージに設置されたスライス灌流チャンバー内で行われます。その後、イメージングカメラの電源を入れると、イメージングシステムを介して、赤外線DICおよびエピ蛍光光学系を備えた正立顕微鏡でスライスが可視化されます。

次に、モニター上でMATLABベースのFSソフトウェアとQ captureカメラソフトウェアを開きます。実験を開始する前に、レーザー光刺激システムを確認し、正常に動作していることを確かめてください。システム動作中のレーザー走査パターンを観察するため、4倍顕微鏡対物レンズの下に紙を1枚置きます。

4～6 MΩの抵抗を持つマイクロ電極を作製するため、ピペットプラーを用いてガラス電極を引きます。次に、細胞標識および形態学的同定のための0.1%ビオチンを含む内部液を電極に充填します。続いて、加圧灌流システムを起動し、人工脳脊髄液（A CSF）をチャンバー内に注入します。

チャンバー内のスライス上方に、常に2.0 mmの液深を維持します。MNIケージドグルタミン酸のストックソリューションの一分量を25 mLの循環A CSFに加え、ケージドグルタミン酸濃度を0.2 mMに調整します。その後、脳スライス1枚を記録チャンバーに移します。

イメージングシステムを動作させてスライス品質を確認し、一次体性感覚野を解剖学的に特定します。次に、特製のプラチナリングを用いてスライスを固定します。この際、記録予定の脳領域の上にアンカーを配置しないよう注意してください。A DIC蛍光顕微鏡を用いてGFP発現を可視化し、60x対物レンズで細胞を観察します。

抑制性細胞の型を特定し、選択します。なお、記録は赤外線DICによる視覚的制御の下で行われます。電極を標的細胞まで下降させる際、GFP発現細胞の位置を確認するために、ビデオモニターによる監視およびDICモードと蛍光モードの切り替えが必要です。

従来のパッチクランプ法を用います。まず、電極に正圧をかけます。電極を細胞表面に近づけ、標的となる細胞膜に明確なディンプルを形成させます。

次に、迅速に陰圧をかけてギガシールを形成し、ビデオモニターで電流注入反応を監視しながらブレイクインを行います。ブレイクイン後、オンラインで確認するため、記録したGFP発現内側神経細胞をDICモードおよび蛍光モードにて60倍の倍率で撮影します。光刺激データを収集する前に、過分極および脱分極電流パルスを注入し、各細胞の基本的な電気生理学的特性を調べます。

安定したホールセル記録が得られ、アクセス抵抗が通常20 MΩ未満という良好な状態になったら、レーザースキャニング光刺激のために、顕微鏡対物レンズを60倍から4倍に切り替えます。4倍の倍率でスライス画像を取得し、それを光刺激部位のガイドおよびレジストレーションに使用します。physの構成スイッチモジュールを起動して、光刺激およびデータ収集パラメータを設定します。刺激間隔を1秒とし、約20 mWの1 msのレーザーパルスを使用します。

光刺激マッピングでは、サンプリング周波数 10 kilohertz で 1 秒間のデータトレースを取得します。次に、4x スライス画像を phys のマッパーモジュールに読み込みます。細胞体（soma）の位置を定義し、80 µm × 80 µm の 16 × 16 パターンで光刺激部位を設定します。

すべての皮質層をカバーするように、細胞の位置周囲に間隔を設けます。次に、カレントクランプモードで光刺激に対するスパイク発生部位を調べることにより、記録されたニューロンの興奮プロファイルをマッピングします。オンライン表示機能を備えたユーザーフレンドリーなソフトウェアにより、マッピング実験が容易になります。

その後、記録細胞から興奮性ポストシナプス電流を検出することで、局所的な興奮性回路の接続をマッピングします。異なる位置でレーザースキャニングを行い、電位クランプモードで細胞を-70 mVに保持して、内向きの興奮性電流を検出します。次に、光刺激パターンを回転または反転させ、興奮性ポストシナプス電流のマッピングを2～3回繰り返します。局所的な抑制性回路の接続をマッピングするには、記録細胞から抑制性ポストシナプス電流を検出します。

外向き抑制性電流を検出するため、この場合はボルテージクランプモードで細胞電位を0 mV近く、具体的には-15 mVに保持します。すべての生理学的アッセイが完了した後、記録した細胞から電極をゆっくりと抜いてください。脳切片をチャンバーから取り出し、4% パラホルムアルデヒドで一晩固定し、記録した細胞をビオチンで染色します。

本実験では、GFPの発現、固有の電気生理学的特性、および形態学的特徴を組み合わせて、抑制性ニューロンを分類します。ここでは、記録した抑制性ニューロンへの局所的な皮質回路接続の広範なマッピングを可能にする、レーザースキャニング光刺激の例と生データのマップを示します。図Dで示した生トレースから導出された、色分けされた定量的な入力マップの例をここに示します。記録した介在ニューロンで検出されたシナプスイベントの振幅が色分けされ、光刺激部位の上に地形学的に重ね合わせられています。

細胞体の位置は、スケールバー内の赤い白抜き円で示されています。暖色は強力なシナプス入力を、寒色は標的細胞への接続が弱いか、あるいは接続がないことを示しています。同様に、図Eは、記録されたニューロンに対する、サンプリングされた光解離位置あたりのシナプスイベント数を示しています。

図Fは、光刺激後、記録細胞で最初に検出されたシナプスイベントの開始時間をスケールバーとともに示しています。暖色は短い入力潜時を、寒色はより長いシナプス潜時を示しています。したがって、LSPSを用いることで、特定の種類の抑制性ニューロンに入力される入力の位置、強度、潜時、および数の詳細なマップを作成することが可能です。

本手順を行う際は、忍耐強く、クリーンな実験条件下で作業することが重要です。また、高倍率から低倍率へと倍率を切り替える際は、ニューロンを効率的かつ非常に慎重に操作してください。最後に、解析ソフトを十分に活用してください。