シロイヌナズナ植物における二元細菌人工染色体ベクターに基づく遺伝子形質転換:シングルコピー挿入によるトランスジェニック植物作製技術

未熟な頭花を持つシロイヌナズナ植物から始めます。大腸菌とアグロバクテリウムの両方のシステムで複製するベクターである二元細菌人工染色体またはBIBACでクローニングされたT-DNAを運ぶアグロバクテリウム細胞懸濁液に花の頭を浸します。このT-DNAバイナリベクターは、除草剤耐性遺伝子や蛍光選択マーカーなどの大きな導入遺伝子を種子特異的プロモーターに沿って送達できます。

花の頭がまだ浸されている間に、植物をそっとかき混ぜて、アグロバクテリウムとの接触を促進します。植物に感染する固有の能力により、アグロバクテリウムは導入遺伝子を花細胞に導入します。導入遺伝子が細胞に入ると、核に移動し、植物ゲノムと融合します。

次に、植物をラップで包み、暗所でインキュベートして湿度を保ち、形質を良くします。フィルムを取り除き、種子が生成されるまで生理学的条件下で植物を育てます。

次に、種子を収穫し、蛍光顕微鏡で観察して形質転換体を選択します。次に、形質転換した種子を発芽まで適切な条件で育てます。植物に除草剤を噴霧し、インキュベートします。

複数の導入遺伝子が挿入された植物は遺伝子サイレンシングを経験して枯れますが、シングルコピー挿入された植物は活性除草剤代謝酵素を発現し、処理を生き延びます。生き残った形質転換体からゲノムDNAを抽出し、PCRを実行してシングルコピー挿入の効率を計算します。

ロイヌナズナ植物の形質転換を準備するには、開花するまで、温室または気候制御された成長チャンバーでシロイヌナズナ植物を育てます。最初のボルトをクリップして、さらに二次ボルトが出るようにします。植物は、植物に未熟な頭花が多く、施肥されたシリクがあまりないとき、刈り取ってから4〜6日後に浸す準備ができています。

花を浸すには、花序をアグロバクテリウム懸濁液に5〜10秒間浸します。穏やかに撹拌してください。植物の地上部分をラップで包んで湿度を高く保ち、植木鉢を箱で覆い、植物を暗所に保管します。

温室または成長室で植物を2日間インキュベートします。2日後、箱とラップを取り外し、温室または成長室で植物を成熟するまで育てます。変換の効率を高めるために、最初の浸漬から7日後に同じ植物を再浸漬することができます。

次に、形質転換した植物が成熟して乾燥したら、種子を収穫します。同じ構成で変換された植物の種子を 1 つのセットとしてプールして分析します。植物がBIBAC-RFP-Gatewayプラスミド誘導体で形質転換された場合は、蛍光顕微鏡を使用して種子を分析することにより、トランスジェニック植物を同定します。

種皮中のDsRed発現を検出するには、560ナノメートルの励起と600〜650ナノメートルの発光で種子を画像化します。鉗子を使用して、蛍光シードを非蛍光シードから分離します。

BIBAC-BAR-Gatewayプラスミド誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、土壌で満たされたトレイに種子を播種します。0.5X MS培地の0.1%寒天に種子を懸濁し、1ミリリットルのピペットを使用して種子を広げることにより、トレイ上に種子が均一に広が

氏4度で少なくとも2日間種子をインキュベートすることにより、種子が同期して発芽するように刺激します。これは、種を蒔く前または後に行うことができます。種を蒔いてから2〜3週間後、苗木に0.5%グルホシネートアンモニウム溶液を噴霧します。1平方メートルあたり500ミリリットルのグルホシネートアンモニウム溶液を使用します。生き残った苗木を鉢に移します。グルホシネート-アンモニウム耐性植物をPCRで分析し、目的の構築物の存在を確認します。