サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

本実験の全体的な目的は、目的のDNA構築物を細菌染色体上のあらかじめ決定された遺伝子座に組み込むことです。これは、4つの操作された細菌株を用いた接合プロトコルによって達成されます。レシピエント株は、スペクチノマイシン耐性遺伝子と、ATP部位に挟まれた大腸菌β-グルクロン酸分解酵素遺伝子からなるランディングパッド配列を染色体内に保持しています。

P JH one 10ドナー株は、スタッファーとして赤色蛍光タンパク質遺伝子を挟むattBサイトと、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを保持しています。PJC twoドナー株は、LACプロモーターの制御下にあるstreptomycesファージC 31由来の部位特異的インテグラーゼを含むプラスミドを保持しています。4つ目の株であるMT 616は、細胞間でのプラスミド転移である接合に必要な転移遺伝子を提供し、受容株を通じてトランスジェニック細胞を作成させます。

インテグラーゼ媒介カセット交換に必要な2種類のプラスミドを調製します。PJ H one 10プラスミド由来のドナーカセットと、染色体上のランディングパッドカセットのマーカーを交換すると、結果として得られるトランス移民からはランディングパッドマーカーであるSPRおよびUIDAが消失し、ドナーカセットのRFPおよびGMRが保持されます。相同組換えなどの他の手法と比較して、本手法の主な利点はプロトコルの簡便さと効率性にあります。

これはまた、多種多様な細菌へと転移可能です。本ビデオで使用する受容菌株はS. milli latte株です。trans-integronを作成するための接合操作の2日前に、単一のコロニーからスペクチノマイシンを含む5 mLのTY培地に接種してください。S. milli株を30 °Cで2日間、振盪培養します。接合操作の前日に、以下の各E. coli株を、適切な抗生物質を添加した5 mLのLB液体培地に接種します。インテグラーゼ発現プラスミドを保持するDH5αはテトラサイクリン添加培地に、動員菌であるMT616はクロラムフェニコール添加培地に、そしてドナーカセットプラスミドを保持するDH5αはゲンタマイシン添加培地に接種してください。これら3種のE. coli株を37 °Cで一晩、定常的に振盪して培養し、接合操作に向けた細胞準備を行います。4つの培養液からそれぞれ1.5 mLをチューブに移し、17,000 ×gで30秒間遠心分離して細胞ペレットを回収します。培地を除去し、各細胞ペレットを1 mLの滅菌0.85%塩化ナトリウム溶液に再懸濁します。上清を除去した後、チューブを再度遠心分離してください。ピペットを用いて、各ペレットを100 µLの滅菌0.85%塩化ナトリウム溶液に再懸濁します。洗浄した各菌株の培養液10 µLを、プレーンなTYアガープレート上に個別にスポットします。

これらのスポットはコントロールスポットです。次に、Pjc2を含むe coli DH5α以外の各菌株を40 µLずつ滅菌チューブに入れ、ピペッティングで混合します。この混合液を120 µL、プレーンなTYアガープレートにスポットします。このスポットが、インテグラーゼ欠損のネガティブコントロールとなります。

最後に、滅菌チューブに4つの株をそれぞれ40 µLずつ加え、混合します。この混合液160 µLを同じTDY寒天プレートにスポットします。このスポットが、インテグラーゼ介在カセット交換（integrase mediated cassette exchange）接合スポットとなります。

プレートを層流クリーンベンチ内に配置し、その後、スポットが乾燥するまで約20分間放置します。プレートを密閉し、交配プロトコルのストリーク操作を行った翌日に、30°Cで一晩インキュベートします。2つのコントロールスポットとIMCE交配スポットを、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを添加したTY寒天培地にストリークします。

S milli 受容菌株は、IMCE効率の算出のため、ストレプトマイシンに対して高レベルの耐性を付与する変異を有しています。IMCE交配スポットの約4分の1を 500 µL の滅菌 0.85% Sodium chloride に懸濁し、10⁻⁷ まで10倍段階希釈を行います。トランス移民（trans immigrants）を選択するため、10⁻² から 10⁻⁵ までの希釈液を、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および xgl を添加した TY 寒天培地に塗布します。また、トランス移民および潜在的な受容菌の両者を選択するため、10⁻³ から 10⁻⁷ までの希釈液を、ストレプトマイシンおよび xgl を添加した TY 寒天培地に塗布します。プレートを 30 °C で3日間培養します。

緑色光の下でRFPトランスジェニックを確認し、赤色フィルターを通して、全レシピエントのCFUに対するトランス移民のCFUの割合としてIMCE効率（%）を算出します。ストレプトマイシンとゲンタマイシンを添加したTy培地で3日間培養した後、トランスジェニックの約半分は真の交換が起こり、白色となり感受性を失います。以下のコントロール株では増殖が見られないはずです：インテグラーゼ欠損コントロールS. mille latte UW 2 27、コントロールE. coli MT 616、P JH one 10コントロールを含むコントロールE. coli DH5α、およびPJC twoコントロールを含むE. coli DH5α。対照的に、交配スポットからのIMCEストリークでは、一次ストリークで融合的な増殖が見られ、二次ストリークで多くのコロニーが見られるはずです。次の2つの画像は、交配スポットの10⁻²希釈懸濁液を、TYストレプトマイシン X-Gal寒天培地およびTYストレプトマイシン・ゲンタマイシン X-Gal寒天培地に播種した様子を示しています。

青色のコロニーは単一組換え体です。一方、白色のコロニーは、緑色光下で赤色フィルターを通して観察した際に真のカセット交換が起こったトランスインテグリンです。TY strept cin xgl agar上の交配スポット再懸濁液の10⁻²希釈系列では、蛍光が見られません。対照的に、Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar上の交配スポット再懸濁液の10⁻²希釈系列では、2段階の蛍光レベルが認められます。

より明るいコロニーは青色のコロニーに相当し、ベクター内のLACプロモーターからのリードスルーが生じているためと思われるが、RFPの発現レベルが高い。明るさの低いコロニーは白色のコロニーに相当し、これらは真のカセット交換が行われており、RFPがその直近のプロモーターのみを保持し、LACプロモーターからのリードスルーがない状態である。これらの傾向にあるコロニーは、スペクチノマイシン感受性であるはずである。

全レシピエントに対するトランス移行菌の割合として表されるトランス統合の効率は、0.5%の範囲内である必要があります。このビデオを視聴することで、我々が構築したエンジニアリング株を用いた細菌接合により、DNAコンストラクトを細菌染色体に挿入する方法について深く理解できるはずです。