薄層クロマトグラフィーに基づく酵素活性アッセイ:薄層クロマトグラフィーを使用してin vitroピロホスホキナーゼ活性を決定する技術

ピロホスホキナーゼは、アデノシン三リン酸(ATP)などのヌクレオチド前駆体からグアノシン二リン酸(GDP)などの基質への二リン酸またはピロリン酸の移動を触媒します。これにより、重要なシグナル伝達分子であるグアノシン四リン酸が形成されます。

ピロホスホキナーゼ活性を決定するには、塩化マグネシウムを添加した適切な緩衝液中に、GDPと放射性標識ATPを含む反応混合物を調製します。所望の量のピロホスホキナーゼを反応混合物に加え、インキュベートします。

時間が経つにつれて、マグネシウムイオンの存在下で、ピロホスホキナーゼは放射性標識ピロリン酸部分をATPからGDPに移動し始め、放射性グアノシン四リン酸を生成します。

次に、薄層クロマトグラフィーまたはTLC、ポリエチレンイミンセルロース(カチオン性ポリマーベースの固定相)でプレコートされたプレートを取ります。反応混合物の分析物のアリコートをさまざまな時点でTLCプレートベースの近くに配置して、反応を停止し、進行状況を評価します。

相溶媒である一塩基性リン酸カリウムを含むガラスチャンバーにプレートを浸漬します。溶媒フロントが上方に移動すると、負に帯電した分析種は、正に帯電した固定相との親和性に基づいて移動し始めます。

リン酸化の異なる分析種の負電荷と重量の違いにより、TLC プレート上での相対的な移動が決まり、異なるバンドとして固定化することができます。

溶媒前面が所望の距離に達したら、プレートを取り外して自然乾燥させます。放射性標識ATP枯渇とグアノシン四リン酸蓄積に対応する放射性シグナル強度を測定して、ピロホスホキナーゼ活性を分析します。

反応を行う前に、PEI-セルロース薄層クロマトグラフィープレートを脱イオン水で洗浄して調製します。プレートを二重蒸留水を入れたガラスチャンバーに、約0.5センチメートルの深さまで置きます。水をプレートの上部に移動した後、プレートをガラスチャンバーから取り出し、ベンチトップラックに置いて一晩乾燥させます。

ドライプレートを片方の端から2センチメートルに柔らかい鉛筆でマークし、サンプルをTLCに適用する場所を示します。2マイクロリットルのサンプルの場合、サンプルを1センチメートル以上離して適用します。実験を計画するときは、サンプル定量のための空白のレーンとして機能するために、常に各プレートの1つのスポットを未使用のままにしてください。

酵素活性アッセイを実行するには、テキストプロトコルに記載されているように、^γ-32P-ATPを使用して個々の反応を調製します。ヌクレオチド含有混合物にRSHを添加すると酵素活性アッセイが開始されるため、他の成分が混合された後にRSHを追加します。

汚染ヌクレアーゼ活性によるATP加水分解を制御するには、タンパク質を含まない10マイクロリットルの反応を組み立て、並行してインキュベートします。t = 0で2マイクロリットルのサンプルをスポットし、実験の最後に、タンパク質の非存在下でATPが加水分解されないようにします。

RSHを添加した直後に、2マイクロリットルを取り出し、t = 0分サンプルとして標識されたPEIセルロースプレートにスポットします。

反応を摂氏37度でインキュベートし、目的の時点で2マイクロリットルのアリコートを除去します。すべてのアリコートが収集されたら、クロマトグラフィーチャンバーに1.5モルの一塩基性リン酸カリウムを0.5センチメートルの深さまで充填することにより、薄層クロマトグラフィーを実行します。プレートの下端を溶媒に浸し、溶媒を約90分間にわたってプレートの上部に移動します。

クロマトグラフィータンクからプレートを取り出し、卓上乾燥ラックに置いて一晩自然乾燥させます。プレートが乾いたら、放射性物質がイメージングカセットに移らないようにプレートをプラスチックフィルムで包み、オートラジオグラフィーで分析します。

分離された反応を含むPEIセルロースプレートを、室温で4時間蛍光イメージョーカセットにさらします。露光後、蛍光体イメージャーでカセットを画像化します。

グラフィカルユーザーインターフェイスを備えたイメージングソフトウェアを使用して、最初に「長方形の描画」を選択して、関心領域(ROI)を描画します。次に、マウスを使用して、1 つのレーン全体の周囲に長方形の ROI と、そのレーン内に含まれる ATP とグアノシン四リン酸スポットを描画します。

「選択、コピー、貼り付け」コマンドを使用して、他のレーン内に同一の ROI を描画し、ROI が各レーンの同じエリア内の信号を測定していることを確認します。空白として使用する未使用のレーンの ROI を含めます。

「分析 |ツール |ROIマネージャー |「追加」コマンドを使用して、PEIセルロースプレートに描画されたすべてのROIを選択します。次に、「分析 |セット測定 |「測定」コマンドを使用して、各ROI内の信号強度を定量化し、測定値をスプレッドシートとしてエクスポートします。スプレッドシートで、実験信号から空白のROI値を減算します。