酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

この実験の目的は、アセテートキナーゼのアセテート生成活性を直接的に測定することです。アセチルリン酸とDP基質を含む反応混合液に酵素を添加して反応を開始させます。その後、塩酸ヒドロキシルアミンを添加し、残存するアセチルリン酸をアセチルヒドロキシレートに変換します。

現像液を加え、アセチルヒドロキシレートを測定可能な有色のフェリックヒドロキシレート錯体に変換します。反応で消費されたアセチルリン酸基質の量に基づいた分光光度法による結果から、酵素動力学パラメータの決定が可能です。既存の手法に対するこの手法の利点は、ATP産生をADPの還元にデカップリングさせるのではなく、アセチルリン酸の消費を直接測定することに基づいている点にあります。このアッセイはATP産生に依存しないため、ATPの代わりにピロリン酸を産生する新しいグループのアセテートキナーゼに使用できます。6〜8点の標準曲線を作成するために、アセチルリン酸ストック溶液を100 mM Trisで希釈し、最終サンプル容量を300 µLにします。また、アセチルリン酸を含まないコントロールサンプルも含めてください。すべてのサンプルを37 °Cのヒートブロックで1分間平衡化させます。

次に、2 Mのヒドロキシルアミン塩酸塩を50 µL加え、3回振って混ぜ合わせ、60 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートします。その後、現色液を100 µL加え、3回振って混ぜ合わせ、室温で少なくとも1分間、呈色させます。分光光度計用のプラスチック製キュベットを用いて、サンプルを遠心分離します。

540 nmでサンプルの吸光度を測定します。適切なデータ解析およびグラフ作成ソフトを用いて、540 nmにおける吸光度とアセチルリン酸のµmol数との標準曲線を作成してください。決定係数（r²値）を算出します。

反応液を300 µLずつマイクロ遠心チューブに分注します。この際、酵素を加えないコントロール反応を含めるようにしてください。チューブを37 °Cで1分間平衡化させます。複数の反応を行う場合は、特定の時間間隔でチューブに酵素を加え、直ちに各チューブを37 °Cのヒートブロックに戻してください。

5分後、2 Mのヒドロキシルアミン塩酸塩を50 µL加え、混合して60 °Cで5分間インキュベートします。次に、現色液を100 µL加え、混合して室温で発色させます。その後、サンプルを18,000 ×gで1分間遠心分離します。

540ナノメートルにおける吸光度を測定します。アセチルリン酸標準曲線と比較して、アセチルリン酸の含有量を決定します。データはプロットし、McKayla Cementin式に当てはめることで、速度論的パラメータを決定することができます。

このアッセイでは、アセチルリン酸基質の消費量を測定することで、酢酸生成方向の酢酸キナーゼ活性を決定します。酵素反応中の一定時間後に残存しているアセチルリン酸は、アセチルオキシバトに変換され、続いて赤色の呈色を示すフェリヒドロキシアセート錯体へと変換されます。この色は 540 nanometers で測定可能です。540 nanometers での吸光度をアセチルリン酸の µmol 数に対してプロットした典型的な標準曲線は、アセチルリン酸 1 µmol あたり 1.2332 吸光度単位の勾配となります。

得られたr squared値が0.99であることは、データがここに示す一次方程式によく適合していることを示しています。このアッセイは、さまざまな酵素調製物におけるアセチルリン酸のKMを決定するために使用できます。5 millimolarのDP存在下で、アセチルリン酸濃度を変化させた際、methanol Sarina thermophilicから精製したリコンビナントアセテートキナーゼは、各基質に対して標準的なMcKayla cementinのようなキネティクスに従い、その結果、アセチルリン酸の見かけのKMは0.27 ± 0.01 millimolarとなりました。

標準的な複合アッセイとは異なり、この直接アッセイでは、TP以外の基質を利用するアセテートキナーゼの活性を測定できます。例えば、ピロリン酸を生成する Entamoeba histolytica アセテートキナーゼによるアセチルリン酸の利用においては、反応液中の DP をリン酸ナトリウムで代用しました。得られた曲線は、アセチルリン酸の見かけの KM 値が 0.50 ± 0.006 mM であることを示しています。このビデオを視聴することで、消費されたアセチルリン酸の量を決定することにより、アセテートキナーゼ活性を直接測定する方法について十分な理解が得られるはずです。

再現性のある結果を得るための重要な要因は、各ステップ、特に酵素の添加と混合の手順において一貫性を保つことです。