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嫌
気性病原菌である活発に成長しているポルフィロモナス・ジンジバリスの懸濁液から始めます。
非蛍光性、細胞透過性色素であるBCECF-AMを追加します。
活性細胞質エステラーゼは、色素を蛍光の細胞不透過性の形に加水分解し、細菌を染色します。
遠心機。嫌気性培地に細菌を再懸濁します。
標識された細菌を、ヒト内皮細胞が付着したカバーガラスを含むマルチウェルプレートウェルに加えます。
嫌気性チャンバーでインキュベートします。
細菌の線毛は内皮細胞表面受容体に結合し、細胞内シグナル伝達カスケードを開始します。
これは、ファゴソーム内でのアクチン再構成と細菌の内在化につながります。
インキュベーション後、カバーガラスをバッファーで洗浄して、内在化していない細菌を除去します。
細胞構造を維持するために、細胞をパラホルムアルデヒドで固定します。細胞を非イオン性界面活性剤で透過処理して、細胞内標的にアクセスします。
アクチンフィラメントに結合する蛍光標識ファロイジンを加えます。
DNAを染色するDAPIを含む封入剤の上にカバーガラスを置きます。
蛍
光アクチンで内皮細胞内の蛍光ポルフィロモナス・ジンジバリスを観察し、細菌の内在化を確認します。
内在化された細菌を視覚化するには、まず、オートクレーブ滅菌されたガラスカバーガラスを12ウェルプレートの各ウェル内に無菌的に移します。カバーガラス上のウェルあたり4つのHUVECに10回5回プレートし、24時間インキュベートします。細菌を標識するには、対数中期細菌を遠心分離し、ペレットを嫌気性PBSで再懸濁します。再度遠心分離し、洗浄ステップを繰り返します。
20マイクロリットルの0.2ミリモルBCECF-AMを、1ミリリットルあたり5〜7倍の10〜8番目の細菌を含む2ミリリットルの嫌気性PBSに加えます。暗所で摂氏37度で30分間インキュベートします。
私たちが使用する蛍光色素は、ほとんどの嫌気性細菌を染色することができます。したがって、特異的抗体などの他の試薬は必要ありません。
細菌懸濁液を5,000倍gで10分間遠心分離して、結合していない標識試薬を除去し、細菌をVEGF培地に再懸濁します。次に、HUVEC細胞を100対1の比率で感染させ、細菌と細胞を感染させ、摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、感染培地を取り除き、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、4%のパラホルムアルデヒドを加え、室温で10分間インキュベートして、嫌気性チャンバー内の細胞を固定します。
固定細胞をチャンバーから取り出し、カバーガラスをPBSで3回洗浄します。カバーガラスを1ミリリットルの0.2%Triton X-100で10分間インキュベートし、細胞を透過性化します。次に、カバーガラスをPBSで3回洗浄します。次に、50マイクロリットルの50マイクログラムのTRITCファロイジンを各カバーガラスに加え、室温で45分間インキュベートして細胞オリゴマーアクチンを染色します。
インキュベーション後、カバーガラスをPBSで3回洗浄します。核染色用の1ミリリットルDAPIあたり1マイクログラムを含むソフトセット封入剤を使用してスライドガラス上のカバーガラスを反転させます。次に、カバーガラスの周囲をマニキュアで密閉し、共焦点顕微鏡下で観察します。