ヒト上皮腸質モデルにおける壊死性腸炎の誘発

ヒト小腸組織由来の陰窩(幹細胞とさまざまな種類の上皮細胞を含む尿細管陥入)を取得します。

腸の陰窩を冷やした地下マトリックスに加えます。

この混合物をマルチウェルプレートに移し、3次元ドームを作成します。

成長培地を加えてインキュベートします。

幹細胞は自己組織化、増殖、複数の種類の腸細胞に分化し、腸球を形成します。

時間が経つにつれて、腸球は腸陰窩に似た三次元の自己更新構造であるエンテロイドに成熟します。

リポ多糖類(LPS、細菌エンドトキシン)をエンテロイド含有ウェルに加え、インキュベートします。

LPS 分子はエンテロイドのトール様受容体に結合し、炎症誘発性反応を開始し、活性酸素種の蓄積をもたらします。これにより、アポトーシスにつながる一連のイベントが引き起こされます。

その結果、エンテロイドの完全性が損なわれ、LPS が内腔に浸透し、炎症反応がさらに激化します。

これは、未熟児の腸内の重度の炎症である壊死性腸炎の発症を模倣しています。

手術室での収集時に、ヒト小腸組織サンプルを冷たいDPBSに入れます。血液や便がなくなるまで、冷たいDPBSで検体を洗浄します。

検体を摂氏4度のRPMI 1640培地に、クリプト分離の準備が整うまで保存します。続行する準備ができたら、検体に便や血液が付着していないことをもう一度確認してください。繊細な解剖はさみを使用して、余分な脂肪や外科用クリップやステープルを取り除きます。標本の重量を量り、約0.75〜2.5グラムの部分を目指します。

次に、組織を0.5センチメートルの断片に切り、30ミリリットルのキレートバッファー#1を含むチューブに入れます。摂氏4度で15分間低速で振ってください。次に、100マイクロメートルのセルストレーナーで組織をろ過し、フロースルーを廃棄します。

ろ過した組織を、30ミリリットルのキレートバッファー#2を含むチューブに加えます。摂氏4度で15分間低速で振ってください。100マイクロメートルのフィルターで組織をろ過し、フロースルーを廃棄します。

この後、後で使用するために500マイクロリットルの基底膜マトリックスを氷上で解凍します。50ミリリットルの円錐形チューブ内の10ミリリットルの冷たいDMEMにティッシュを加え、手で10秒間激しく振ってください。この懸濁液を100マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、フロースルーを回収します。このチューブを氷の上に置いてください。

別の50ミリリットルの円錐形チューブ内の別の10ミリリットルの冷たいDMEMにティッシュを加え、手で10秒間激しく振ってください。この懸濁液を100マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、フロースルーを回収します。

1から4までラベル付けされたフロースルーを含む4つの円錐形のチューブができるまで、このプロセスをさらに2回繰り返します。次に、チューブ番号1の溶液を100マイクロメートルのセルストレーナーを通してろ過し、フロースルーを同じく番号1とラベル付けされた15ミリリットルの円錐形チューブに移します。チューブ2から4について、このプロセスを繰り返します。

15ミリリットルのチューブを200倍g、摂氏4度で15分間遠心分離します。層流フードで、各チューブから上清を取り除き、廃棄します。ペレットのすぐ上の組織の雲を破壊することは避けてください。各チューブで、ゆっくりと上下にピペットでペレットを残りの上清と混合します。

混合物を各チューブから単一の2ミリリットルの円錐形チューブに移し、200倍gおよび摂氏4度で20分間遠心分離します。この後、上清を除去し、ペレットを500マイクロリットルの解凍済み基底膜マトリックスに再懸濁します。

冷やしたピペットチップを使用して、50マイクロリットルのこの懸濁液を24ウェルプレートのウェルの中心に塗布します。このサンプルはドーム型に見えます。この塗布プロセスを9回繰り返して、合計10ウェルを充填します。

24ウェルプレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに30分間移し、重合させます。次に、500マイクロリットルのヒトミニガット培地を各ウェルに加えます。同じ条件下でインキュベートを続け、この培地を2日ごとに交換するようにしてください。