蛍光In Situハイブリダイゼーションによる膀胱生検切片の細菌の可視化

病原性細菌を含む脱パラフィン化および再水和された感染した膀胱生検組織切片を運ぶスライドガラスから始めます。

蛍光標識ユニバーサルプローブ(細菌の16sリボソームRNA、または16s-rRNAの保存領域に特異的な相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド)を導入します。

最適なハイブリダイゼーションのために、スライドを高温の暗所でインキュベートします。

インキュベーション中、プローブは細菌16s-rRNAの保存された領域にのみハイブリダイズし、細菌に緑色の蛍光を与えます。

ハイブリダイゼーション後、予め加温したバッファーで洗浄して、結合していないプローブを除去します。

組織切片をヘヒスト色素と蛍光色素標識細胞タンパク質マーカーで染色します。

ヘクスト分子は DNA に結合して核を青色に染色し、蛍光色素標識マーカーはムチンやアクチン フィラメントなどの特定の細胞成分と相互作用し、生検切片に赤色蛍光を与えます。

スライドを洗浄し、組織切片に封入剤を追加します。

共焦点顕微鏡下では、赤色蛍光を運ぶ膀胱生検セクション内の緑色の蛍光が組織関連細菌を確認します。

P1000チップボックスのリザーバーに、浸してしわくちゃにしたデリケートな作業用ワイプと滅菌水を追加して、各プローブの加湿チャンバーを準備します。チップホルダーカートリッジは、スライドが置かれる場所であるため、上に置きます。最終洗浄が完了したら、スライドをスライドラックから取り外し、ティッシュ側を上にして新しいペーパータオルの上に置きます。デリケートな作業用ワイプを使用してスライドを乾かし、水を吸い取るために生検セクションの近くを軽くたたくだけで、生検セクションの近くを軽くたたくように注意してください。疎水性ペンを使用して、生検セクションの周りに境界線を描き、スライド組織側を上にして加湿チャンバーに置きます。

次に、加湿チャンバーを摂氏50度に設定されたインキュベーターに入れます。50〜150マイクロリットルの染色液を組織の真上に直接ピペットで入れて、組織の周りの疎水性境界によって作られた長方形が満たされるようにし、箱をそっと閉じます。暗闇の中で摂氏50度で一晩インキュベートします。インキュベーターに窓がある場合は、アルミホイルで覆い、暗い環境を作り出します。

翌朝、加湿チャンバーからスライドを取り出し、残っているハイブリダイゼーション溶液をデリケートなタスクワイプで素早く吸い取り除きます。次に、スライドを垂直の染色ラックに置きます。染色ラックを、100mlの予熱した洗浄バッファーが入ったアルミホイルで包まれたコプリンジャーに10分間入れます。新しいコプリンジャーに新鮮な洗浄バッファーを使用して、この洗浄ステップをさらに2回繰り返します。

これらの洗浄ステップ中に、Hoechst 33342のストック溶液を洗浄バッファーで1〜1,000の比率で希釈して対比染色を調製します。同じチューブに、Alexa-555小麦胚芽凝集素を最終濃度5マイクログラム/ミリリットルまで、Alexa-555ファロイジンを最終濃度33ナノモルまで加えます。使用する準備ができるまで暗所に保管してください。

最終洗浄が完了したら、コプリンジャーからスライドを取り出し、デリケートな作業用ワイプで余分な洗浄バッファーを優しく吸い取ります。スライドをティッシュ側を上にしてペーパータオルの上に置き、50〜150マイクロリットルの対比染色を組織の上に直接加えて、疎水性の境界が満たされるがあふれないようにします。最大4枚のスライドをクライオボックストップで覆い、室温で10分間インキュベートします。

この後、スライドを染色ラックに戻し、新鮮な洗浄バッファーを含むコプリンジャーでさらに2回洗浄し、各洗浄を10分間持続させます。次に、スライドを完全に乾燥させ、クライオボックスの上部の下のペーパータオルの上にティッシュ側を上にして置きます。組織の上に封入剤を1滴垂らし、適切なサイズのカバーガラスをそっとその上に置きます。気泡をそっと押し出し、カバーを滑らせたスライドを暗闇の中で一晩硬化させます。翌日、カバーガラスの端を透明なマニキュアを薄く塗ってスライドに密閉し、暗闇で10分間乾燥させてから、摂氏4度の暗所に保管します。

染色された生検を画像化する準備ができたら、共焦点顕微鏡と顕微鏡に関連付けられたソフトウェアの電源を入れます。FISHポジティブスライドから始めて、コンピューター視覚化モードに切り替えます。405、488、および 555 のチャネルを選択します。最長の波長チャネル(この場合は555)を使用してピンホールを設定します。次に、488チャネル内の標識細菌を視覚化するための現在の焦点面を見つけます。焦点面を変更せずに、信号が飽和せず、背景が過剰に補正されないように、各チャネルのゲイン、レーザー出力、およびオフセットを設定します。3つのチャンネルすべてで画像を取得します。