蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

この手順の全体的な目的は、線虫宿主内における蛍光標識された細菌の共生状態を観察することです。まず、コンジュゲーションを通じて細菌を蛍光タンパク質で標識します。次に、卵を回収してAIC線虫を単離します。

次に、AIC線虫を蛍光標識した共生細菌とともに培養し、自然な共生関係を形成させ、最終的に線虫宿主内での共生細菌の局在を可能にします。そして、線虫集団におけるこの共生関係の頻度を蛍光顕微鏡によって決定できます。この手法は、細菌が宿主内のどこに局在するのか、また宿主集団における細菌保有の分布はどうなっているのかなど、共生分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

細菌株を一夜培養した後、ドナー株、レシピエント株、およびヘルパー株を、抗生物質を含まない栄養豊富な増殖培地に、菌液と培地の比率が1:100となるように継代し、各菌株に適した温度で対数増殖期の中期に達するまで培養します。次に、これらの菌株を1本のマイクロ遠心チューブにまとめ、17,900 Gで2分間遠心分離します。上清をデカンテーションで除き、沈殿物を30 µLの新鮮な培地で再懸濁します。その後、この懸濁液を抗生物質を含まない栄養豊富な培地プレート上にスポットし、懸濁液を乾燥させます。

プレートを逆さまにし、受容菌にとって最適であり、かつ（該当する場合は）供与菌およびヘルパー菌にとっても許容可能な温度で一晩インキュベートします。次に、スポット部分を掻き取り、選択的抗生物質プレート上で単一コロニーが得られるようにストリークし、細菌の純粋培養株を回収するための単一コロニーを分離します。最後に、得られたコロニーが供与株ではなく、受容共生菌であることを確認してください。

受容体特異的な表現型の有無をスクリーニングすることで判定します。例えば、触媒試験を行うことでcino abdi細菌とe coliを区別でき、また、蛍光プラスミドタンパク質に対応する波長で蛍光を確認することで、プラスミドの存在をスクリーニングできます。天然の細菌共生体を一晩培養した後、細菌培養液600 µLを8〜10枚の10 mm脂質アガープレートに塗布し、プレートを暗所で湿気を避けて25 °Cでインキュベートします。

2日後、500 µLの培地に懸濁した5,000匹の感染期幼虫線虫を細菌ローンに加えます。プレートを25 °Cでさらに3日間インキュベートした後、顕微鏡スライドガラス上に20 µLの水を滴下します。次に、滅菌スティックを用いて細菌ローンから少量の線虫を掻き取ります。

スティックを水に入れ、線虫を泳ぎ出させます。このスライドを低倍率で観察してください。卵と雌が確認でき、かつ雌が卵を保持している場合は、プレートの表面に数mLの水を加え、プレートを静かに回した後、その水を50mLコニカルチューブに注いでください。

線虫がプレートから剥離し、プレート表面に見えなくなっていることを確認してください。線虫をチューブの底に沈殿させた後、チューブ上部の余分な水をピペットで除き、きれいな水で満たします。成虫の線虫を再び沈殿させ、もう一度余分な水をピペットで除いた後、コニカルチューブに卵溶液を満たします。

次に、チューブを室温で正確に10分間、緩やかに転倒混和します。混和後、直ちに遠心管を室温、1, 250 Gsで正確に10分間、ブレーキをかけた状態で遠心分離します。その後、速やかに上清をデカントし、ピペッティングによりペレットを卵溶液で再懸濁させ、遠心管に新鮮な卵溶液を満たします。

チューブを3〜5回反転させて卵懸濁液を十分に混合し、直ちに卵をペレット化して、示した通りに上澄みをデカントします。ピペッティングによってペレットをmisogynyブロスまたはLBで再懸濁し、卵懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。次に、15 mLチューブにLBを満たし、先ほど実演した迅速な手順と同様の手法で、ブロス中で卵を3回洗浄します。その後、再懸濁したP nematode卵を、少なくとも10 eggs/µLになるよう希釈します。

卵を、5 mLのLBおよび定着細菌に対する抗生物質を含む6 cmのペトリ皿に移します。プレートは、一晩の培養と蛍光細菌の選別後、パラフィルムで包んで最大4日間保存することが可能です。滅菌したスティックを用いて、600 µLの細菌培養液を10 mmの脂質アガーに塗布し、25 °Cで培養します。

2日後、各脂質プレートに500から5,000個の線虫卵を分注します。プレートを保存していた場合は、あらかじめ準備した細菌ローンに卵を接種する前に、先ほど示した方法で15 millilitersのLBで卵を少なくとも1回洗浄してください。その後、線虫と細菌の共培養物を、プレートの縁に感染幼虫が白い綿状のリングとして現れるまで、25 degrees Celsiusの暗所かつ低湿度条件下でインキュベートします。

感染期幼虫が観察されたら、脂質アガープレートの蓋を取り外し、プレートの底面を空の100 mm × 20 mmペトリ皿の底に置きます。次に、ペトリ皿に、小さい方のプレートの高さの約半分まで届く量の水を満たし、次世代の感染期幼虫が水中に現れるまでウォータートラップで培養します。

水中から、あるいは適切な細菌ローンから目的のライフステージの線虫を回収した後、少量のoleを30 µLの水に溶解し、線虫サンプル50 µLあたり1～2 µLのこの麻酔剤を加えます。次に、麻酔状態の線虫サンプルを約20～30 µL顕微鏡スライドに転移させ、サンプルの上にカバーガラスを載せます。光学顕微鏡を用いて線虫を観察し、視野内に線虫が存在することを確認してください。

細菌の局在を確認するため、明視野顕微鏡設定に加えて蛍光顕微鏡で線虫を撮影し、その後、画像を重ね合わせます。細菌を特定するために、線虫の倍率や視野を数回変更して試みる必要がある場合があります。

2種類の培地で飼育した線虫の個体数をカウントし、細菌共生体の定着状況をスコアリングしました。統計的な信頼性を確保するためには、表に示すように、1サンプルあたり少なくとも100匹の線虫をカウントし、各カテゴリーに少なくとも30匹が該当することが望ましいです。これらの線虫の定着率は、脂質アガーで飼育した場合は約14.6％、肝臓・腎臓アガーで飼育した場合は68.6％でした。

他の線虫および細菌種では、定着レベルが異なることが示されています。この図式は、Steiner NEMA雌の一般的な外見を示しています。挿入図は、20倍の倍率で撮影したS fot graphic雌の微分干渉像です。

挿入図の黒い矢印は陰門を、白い矢印は視認できる卵を示しています。この画像は、発生しているがまだ孵化していない 40倍 拡大の線虫の卵を示しており、これらの Volta 線虫から単離された卵は 10倍 拡大で撮影されました。ここでは、Xeno aptus 細菌に関連する Steiner Nima 線虫の代表的な顕微鏡画像が、この最初の画像に示されています。

この合成画像を作成するために、Alvinの線虫とその共生細菌（GFPを発現）を組み合わせました。位相差像に蛍光像を重ね合わせています。矢印は、感染幼若線虫内に存在する細菌を示しています。

この画像は、X nlaを発現するGFP標識されたS carpa capsiの幼若線虫を示しています。この画像は前述の画像と同様の手法で作成されており、線虫の腸管腔全体に局在する緑色の桿状の構造として可視化された、緑色蛍光タンパク質で標識された細菌を伴う幼若線虫を描写しています。上述の手順に加えて、ホストと微生物の共生に必要な分子メカニズムは何かといった追加の疑問を解決するために、線虫ホストとの共生前に細菌共生体を遺伝的に操作するなどの他の手法を取り入れることも可能です。