二重ヒト化BLT(骨髄、肝臓、胸腺)マウスモデルの生成

免疫細胞を欠く麻酔をかけた免疫不全マウスから始めます。

マウスを亜致死量のX線で治療し、骨髄から既存の幹細胞を除去します。

マウスを解剖し、ヒト胎児の肝臓と胸腺組織の断片を腎臓とそのカプセルの間に送達します。

切開部を閉じます。

移植された肝臓と胸腺組織は成長し、臓器に似た細胞凝集体であるオルガノイドを形成します。

回復後、ヒト造血幹細胞またはHSCを尾静脈に注入します。

注射された造血幹細胞は胸腺オルガノイドと骨髄に移動し、さまざまなヒト免疫細胞に分化します。

既存の腸内微生物を殺すために、抗生物質を補給した水をマウスに与えます。

経口チューブを使用して、ヒトの糞便微生物をマウスの腸に直接導入し、微生物のコロニー形成を促進します。

これにより、ヒト免疫系と腸内微生物を特徴とする二重ヒト化BLTマウスモデルが開発されました。

肝臓と胸腺組織を左腎嚢に移植するには、まずマウスをフードに入れます。手術当日、マウスを体重線量1グラムあたり12センチグレイの全身亜致死放射線照射で治療する。適切な鎮静レベルを確認した後、各マウスの左側と内側の周りを剃ります。動物の目に眼科用軟膏を塗布し、必要に応じて耳タグを貼り、3回の連続したヨウ素と70%イソプロパノールスクラブで皮膚を消毒します。

皮膚が準備されたら、鉗子を使用して1〜1.6ミリメートルの立方体のヒト胎児肝組織断片をトロカールにロードし、続いて1〜1.6ミリメートルの立方体のヒト胎児胸腺組織断片を1つロードします。鉗子を使って皮膚を持ち上げ、メスを使って皮膚に小さな縦方向の切り込みを入れます。マウスの左側で切り口を1.5〜2センチメートルに伸ばし、鉗子を使用して筋肉層を持ち上げます。はさみを使って筋肉層を縦方向に開き、必要に応じて切り口を伸ばして腎臓を露出させ、腎臓を取り巻く脂肪組織をそっとつか

メスを使用して腎臓カプセルの後端に1〜2ミリメートルの切開を行い、事前にロードされたトロカールを腎臓の長軸と平行に切開部にゆっくりと挿入します。腎臓の被膜と腎臓の間の組織を解放し、腎臓と腸を正常な位置に戻します。次に、縫合糸を使用して筋肉層を閉じ、外科用ステープルを使用して皮膚を閉じます。マウスをオートクレーブ処理されたマイクロアイソレーターケージに入れ、完全に横臥するまで監視します。手術の6時間後、マウスをヒートランプの下に置き、70%イソプロパノールでテイルを消毒します。

1.5〜5 x 10 5 CD34陽性のヒト胎児肝組織単離造血幹細胞を200マイクロリットルのPBSで、動物ごとに1つの拡張した尾静脈に注入します。次に、穏やかな圧力で出血を止め、マウスをホームケージに戻します。手術後9〜12週間で、適切なサイズのプラスチック製コーン拘束具を使用して、1匹のヒト化マウスの片足を分離し、分離された脚の内側に70%イソプロパノールをスプレーします。抗生物質と鎮痛軟膏を採取部位に広げます。

90度の角度で保持された25ゲージの針を使用して、伏在静脈に穴を開けて、EDTAでコーティングされた採血管に50〜100マイクロリットルの血液を採取します。適切な量の血液が得られたら、マウスをケージに戻す前に、滅菌ガーゼでその部位に圧力をかけて出血を止めます。次に、収集した末梢血サンプルを使用して、ヒトCD45、CD3、CD4、CD8、CD19、およびマウスCD45に対する抗体を使用して、フローサイトメトリーによってヒト免疫細胞再構成のレベルを評価します。

新鮮な糞便サンプルを採取するには、オートクレーブ滅菌した紙袋を個別にヒュームフードに入れ、各動物が排便するまで各袋にマウスを1匹入れます。次に、マウスをケージに戻し、滅菌鉗子を使用して各糞便サンプルをマウスあたり1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏マイナス80度で保存します。

14日間の抗生物質治療の終わりに、飲料水をオートクレーブ滅菌水に変更し、マウスを新しいオートクレーブケージに移します。抗生物質の中止から24時間後と48時間後、適切に準備された糞便微生物叢移植材料の供給源を充填し、嫌気性条件下で嫌気性チャンバーにサンプルを分注します。

糞便移植を行うには、200マイクロリットルの糞便微生物叢移植材料を経口強制経口経口を介して各実験動物に送達し、残りの解凍材料をヒト化マウスの毛皮またはケージの寝具に広げます。