光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

この手順の全体的な目標は、最新の光遺伝学的手法を適用して、in vitroスライス調製物で標的ニューロン経路を光刺激することです。これは、まず目的のニューロン細胞株にチャネルロッドDossinを発現させることによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、研究対象の関連する脳構造の急性スライス調製を作成することです。

次のステップは、チャネルの光刺激に応答してスライス調製中のニューロンからの応答を記録することであり、ロッドドッシンは繊維を発現します。最後のステップは、ニューロンとファイバーを発現するチャネルオプシンの分布を画像化することです。最終的に、このアプローチにより、光遺伝学的に標的化された神経成分のレーザー走査型光刺激を使用して、神経回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性の評価が可能になります。

従来の電気刺激法に対するこの技術の主な利点は、特定のニューロン細胞タイプを特異的に標的にして刺激し、in vitroでそれらの長距離投射を調べる能力です。この方法は、複雑なウォーソケットの機能的組織化など、システム神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。トランスフェクションを強化するために、ポリリットルあたり4マイクログラムを含むウイルス溶液を注入するための注射器と針を準備します。

次に、シリンジポンプを使用して200ナノリットルの溶液を圧力注入すると、2〜3週間後にチャネルロッドドッシンスライスが十分に発現します。準備はできるだけ早く行う必要があります 注射された脳を取り除いた後、きれいなかみそりの刃を使用して脳のブロックを希望の向きに作ります。次に、脳のブロックされた表面を瞬間接着剤を使用して切断ステージに貼り付けます。

次に、ステージを冷凍庫で冷やしたビブラムカッティングチャンバーに移し、氷冷したCSFをカッティングチャンバーに注ぎます。バイオムを使用して脳の切片を4〜500ミクロンの厚さの切片にスライスします。脳スライスを酸素化された保持チャンバーに移し、実験を進める前に少なくとも1時間摂氏30度でインキュベー

実験を開始する準備ができたら、脳のスライスを電気生理学的記録装置のステージに移します。標準的な全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンを記録。ピペットに陽圧を加えながら、記録ピペットをニューロンのそばに短時間配置します。

セルに接触した後、圧力を解放し、吸引を加えてギガシールを形成します。次に、短時間の吸引を適用してメンブレンを壊し、全細胞構成にし、電圧または電流クランプモードで録音します。レーザースキャナーは、潮波またはEFAデータ収集ソフトウェアで操作します。

レーザーの出力を制御するために、使用前にソフトウェアをフォトダイオードにキャリブレーションする必要があります。可変NDホイールがその経路に配置されます。ホイールを回転させると、後焦点面で測定することにより、レーザーの出力が調整されます。

通常、電力は 25 から D ミリワットの間に設定されています。シャッターのパルスパラメータは、ソフトウェアでの刺激の長さとタイミングを制御します。グラブビデオ機能から刺激する領域のイメージを作ることができます。

次に、80ミクロンの間隔で16×16のグリッドなどの刺激グリッドを設定します。次に、取得した画像にグリッドを重ね合わせ、XY座標とオフセットの度数を調整して、刺激を開始するための向きを最適化します。マップ機能を有効にします。

データは保持され、潮汐波のオフライン分析プログラムを使用して分析するか、EFAソフトウェアのマップ分析プログラムを使用して分析できます。スライス上での生理学的記録が完了した後、YFPタグ付きチャネルオプシンの発現パターンを文書化することができます。まず、スライスを摂氏4度で0.01モルPBS中の4%PFAで一晩固定します。

翌日、スライスを30%スクロース4%PFA溶液に移し、一晩凍結保護します。翌日、クライオスタットでスライスの50ミクロン切片を切断します。スライスをPBSですすぎ、共焦点顕微鏡で退色防止培地でイメージングするためにマウントします。

白色光の関心領域を見つけたら、514ナノメートルの興奮波長と527ナノメートルの発光波長を使用します。チャネルロッドDobson、EYFPの発現を促進するYFPAウイルスコンストラクトをイメージングする。興奮性グルタミン酸作動性ニューロンをBSYマウスの一次視覚野に注入した。

ウイルス発現は、一次視覚野と二次視覚野の間のトラック、および星によってマークされた二次視覚野のニューロンからのLGN全細胞パッチクランプ記録の皮質視床線維で見出された。チャネルのレーザー走査光刺激に続いて、一次体性感覚皮質の第6層からのV2つの皮質視床突起の下層で繊維を発現するロッドドッシン。腹側後核は、CRE LAXアプローチを使用してチャネルロッドドッシンを第6層皮質視床ニューロンで発現するために研究され、それらの投射では、群れのAおよびVコンストラクトによるCREトランスジェニックマウスへのトランスフェクションにより、標的の第6層ニューロンとその繊維が第4層に伸びるチャネルロッドドシンが発現しました。

チャネルロッドドブソン、EYFPの発現は、VPニューロンからVPに突出する生理学的記録に突出する線維でも認められました。全細胞パッチクランプを用いたところ、星でマークされた記録されたニューロンの近くで光刺激を受けた後、e PSCが誘発されることが明らかになりました。オフライン解析は、VPの光刺激に対する平均応答振幅を示しています チャネルを発現する第6層皮質視床ニューロンの50ミクロンスライスを再切除した ロダンEYFPは、第6層から第4層まで横断する標識線維の微細なパターンを明らかにしました。

さらに、皮質視床線維が白質に入り込み、視床に向かって横切っていることが観察されました。このビデオを見れば、最新のオプトジェネティクス技術をin vitroスライス調製物の光刺激標的ニューロン経路にどのように適用するかについて十分に理解できるはずです。レーザーでの作業は、この手順に関連するキャリブレーション手順を実行するときに非常に危険であることを忘れないでください。

保護メガネを着用してください。