動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

本実験の全般的な目的は、光トラッピングと回転ディスク共焦点顕微鏡を組み合わせて、宿主と病原体の相互作用をリアルタイムで観察することです。まず、目的の病原体をチャンバー付きカバーガラスに添加します。次に、粒子を選択し、光トラップで捕捉します。

最後に、粒子を目的の細胞へと誘導します。このように。光学的トラッピングは、2つの粒子を制御し、細胞内の動的な相互作用を観察するための有効な手法となり得ます。

この手法は、感染症や免疫学の分野における宿主と病原体の相互作用に関する重要な疑問に答えることができます。例えば、宿主細胞と病原体の空間的関係を完全に制御できた場合に、それが食作用にどのような影響を与えるか、また、食細胞に取り込まれる病原体の順序がファゴソームの成熟に影響するか、といった点です。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞やビーズの種類に応じてトラッピング条件を最適化する必要があるため、習得に苦労します。この手法の視覚的な実演は、スピニングディスクのセットアップと統合プロセスにおいて極めて重要です。

光学トラップへの共焦点配置は、すべての光学部品に精密なアライメントが必要となるため、概念化が困難です。目的の病原体を回収します。例えばここでは、ブロス中で一晩培養した Candida albicans 300 µLを培養液から取り出し、病原体を1.5 mL反応チューブに移します。

次に、室温で約1300 Gsで5分間、病原体を3回洗浄し、その都度上清を吸引してペレットをそのままにしておき、再懸濁用のPBSを加えてソニケーションを行います。3回目の洗浄後、ペレットを500 µLのPBSに再懸濁します。次に、1 mgのdye of entrustを100 µLのジメチルホルムアミドに溶解し、最終濃度を10 mg/mLにします。

次に、洗浄した病原体が入った反応チューブに、3 µLの染料混合液を加えます。染料は光に敏感であるため、チューブの周囲にアルミホイルを巻き、37 °Cで1時間振とうした後、前述と同様にPBSで3回ペレット化および洗浄を行います。最後の洗浄後、ペレットを300 µLのPBSに再懸濁します。

トリプシンおよびPVSをウォーターバスで37 °Cに予熱します。RAW 264.7マクロファージがコートされた10 cm組織培養プレートをPBSで2回洗浄し、各洗浄の間にPBSを吸引して除去します。次に、プレート表面を5 mLのトリプシンで覆い、37 °Cで5分間インキュベートします。

次に、プレートの側面を軽く叩いて、細胞をプレート表面から剥離させます。この際、トリプシンがプレートの外に飛び散らないように注意してください。ここで、5 mLの培地をプレートに加え、混合液を反応チューブに移します。

ペレット化した後、ペレットを乱さないように注意しながら培地を吸引し、ペレットを10 millilitersの培地で再懸濁します。チャンバースライドの各チャンバーに400 microlitersの培地を加え、次いで各チャンバーに細胞懸濁液を5 microlitersずつ加えます。細胞を37 °C、5%CO2のインキュベーター内で一晩培養します。

インキュベーターからチャンバースライドを取り出し、あらかじめ調製した目的の蛍光標識病原体を、マクロファージが入った各チャンバーに5〜10 µLずつピペッティングします。ピペッティングによる吸い上げと吐き出しを繰り返し、マクロファージと病原体を十分に混合させます。この際、チャンバーの底に触れて接着したマクロファージを乱さないよう注意してください。回転ディスク共焦点顕微鏡のすべてのコンポーネントの電源を入れます。

油浸対物レンズにオイルを滴下し、顕微鏡の準備をします。チャンバースライドを専用ステージに挿入し、チャンバースライドの上部を取り除いた後、DICイメージング用に顕微鏡の調整を行います。光学トラップのシャッターとIRレーザーをオンにします。

次に、オプティカルトラップへのレーザーシャッターを開けます。IRカードで確認し、IRレーザー前のシャッターが閉じていることを確認してください。これで、接着スライド上のマクロファージに焦点を合わせます。

次に、マクロファージに隣接して溶液中に自由に浮遊している病原体を探します。この手順で最も困難なのは、サンプルチャンバー内の物体とカバーガラスの間の付着力のため、サンプルチャンバー内で追跡すべき適切な物体を見つけることです。その物体を移動させるには、トラフィックレーザーで物体を保持したままステージを移動させる必要があります。また、ステージの抗力がトラップによる最大捕捉力を超えないように、十分に低速でステージを移動させることが重要である点にも注意してください。

病原体がトラップの付近に来るようにステージを移動させます。次に、シャッターを開き、トラップを作動させます。サンプルを移動させ、マクロファージを固定されたトラップ内の病原体像に接触させます。

回転ディスク共焦点顕微鏡を用い、DIC蛍光またはその両方を組み合わせた手法で病原体を観察した。通常約5 µmのサイズであるCanada albicansの独立した集団を、それぞれ緑色、青色、赤色にラベル化した。イメージングの例として、単一のC albicansを捕捉し、グレーの矢印で示すように他の酵母のクラスターの中を四角いパターンで移動させた。これにより、混み合った環境下であっても、操作者が選択した特定の単一病原体の位置を捕捉し、操作できる能力が実証された。また、病原生物が示す異なる形態を捕捉できる本システムの柔軟性をさらに示すため、光ピンセットを用いて偽菌糸（pseudo hyphy）を持つC albicans粒子を保持し、配置させた。

C. albicansを赤色染料で標識し、白い矢印で示された軌道に沿って移動させ、緑色に蛍光を発するGFPL C3未分化細胞の隣に配置しました。albicansの酵母様細胞部分は、偽菌糸が後方に伸びるにつれて捕捉されました。

この特定の細胞株と病原体を用いた食作用の絶対的なタイムフレームを分析するため、Aspergillus fumigatusをマウス生原脈管細胞の隣に配置しました。この図の明視野像では、白矢印で示される捕捉されたAspergillusが、赤矢印で示される経路に沿って移動し配置された様子がわかります。捕捉された病原体は、トラップによって生物体が焦点面よりわずかに上に押し上げられたため、わずかに焦点が外れています。

Aspergillusを目的の未処理細胞の隣まで移動させました。病原体が細胞に接触した時点で、トラップをオフにしました。その後、食作用プロセスを活性化させ、タイムラプスイメージングを用いてそれに続く細胞内イベントを観察しました。

30秒後、未処理細胞の細胞膜に変化が生じ、粒子を囲むようにカップ状の構造が形成され始めました。60秒後には、このカップが完全に形成されました。90秒から150秒にかけて、Afu Gottiが粒子を包み込み、180秒までに粒子は完全に内部に取り込まれました。

このビデオを視聴することで、回転ディスク光トラップ装置の作製方法と、開発後のこのような装置を用いて、生細胞イメージングのために病原体を非侵襲的に制御する方法について深く理解することができます。この手法により、宿主・病原体相互作用の分野の研究者が、宿主細胞と病原体の空間的関係の役割と、それがその後の免疫応答に及ぼす影響を調査することが可能になりました。