長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

本実験の全体的な目的は、epi airwayモデルを用い、非定型血性インフルエンザ菌（Nontypeable Hemophilus influenzae：NTHI）とヒト原代呼吸器上皮組織の長期共培養を行うことです。これは、第2段階としてNTHIを頂端面に接種し、細菌を組織に付着および侵入させることで達成されます。インサートは、通常の粘液の流れを模倣し、ムチン廃棄物や細胞破片を除去するため、24時間ごとに予熱したDPBSで洗浄します。

次に、任意の時点で組織を回収し、全細胞結合性または内部移行したNTHIの生存率を測定します。最終的に、この手法を用いることで、生菌数に基づいた組織内におけるNTHI生存の菌株特異的な経時的特性を評価することが可能です。この手法は、非型化インフルエンザ菌による長期感染に関する知見を提供することができます。

本手法は、Moraxella Alisなどの他のヒト病原体の研究にも利用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士研究員であるDr.Doinが行いました。輸送プレートをパッケージから取り出し、実験の準備をします。輸送プレートに70% ethanolをスプレーし、プレートをバイオセーフティキャビネット内に設置します。

6ウェルプレートの各ウェルに、4 °Cに冷却したEpiAirway維持培地を1 mLずつ分注します。次に、テープを剥がしてプレートを開き、EpiAirwayインサートを覆っているガーゼを取り除きます。ピンセットを用いて、ひねるようにしてインサートをArosから取り出します。

必要に応じて、インサートを6ウェルプレートのいずれかのウェルに配置します。滅菌綿棒を使用して、メンブレンに触れないように注意しながら、インサートからエアロスを慎重に取り除いてください。インサートの下に気泡が閉じ込められていないことを確認します。

その後、6ウェルプレートをインキュベーターに入れます。インサートの洗浄を毎日次のように行います。カルシウムおよびマグネシウムを含むDPBSを予熱し、チップにDPBSを吸い上げます。次に、滅菌済みのピンセットでインサートをそっと持ち上げ、組織上に予熱したDPBSを200 µLピペッティングします。

次に、組織に触れないようにインサートを揺らし、DPBSを均一に分散させます。続いて、インサートを傾け、インサート底部のメンブレンを保持しているプラスチックリングにP 1000ピペットチップを当てます。その後、緩衝液を慎重に吸引し、後で解析するためにクライオチューブに移します。

最後に、底層の維持培地を吸引し、1 mLの新鮮な培地と交換します。カルシウムおよびマグネシウム含有DPBSをさらに予熱しておきます。予熱したDPBS 3 mLを15 mLチューブに加え、チョコレート寒天培地で一晩培養したnon-typeable influenza（非型インフルエンザ菌）またはNTHIの単一コロニーをそのチューブ内で再懸濁します。

チューブを10秒以上激しくボルテックスし、光学的密度を測定します。細菌濃度がOD 600 nmで約0.7に達するまで、NTHIの単一コロニーを追加し続けます。次に、前述と同様に各EPI気道インサートをあらかじめ温めておいたDPBSで洗浄し、各インサートの頂端面に細菌懸濁液を28 µL添加します。

基礎維持培地への接種を避けます。その後、プレートをインキュベーターに戻してNTHIを定量します。まずチョコ agarプレートを予熱し、次に表面を乾燥させます。次に、0.1%ゼラチン含有滅菌PBSまたはPBSGを用いて、NTHI接種液を段階希釈します。

接種液を10 µLずつプレートに滴下し、5% CO2条件下、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、各滴下に15～30個の独立したコロニーが形成されている希釈段をカウントし、NTHIの実際の生存接種量に換算して1 mLあたりのCFUを算出し、細胞結合細菌の総数を回収します。エピエアウェイの頂端面を、カルシウムおよびマグネシウム不含のDPBS 200 µLで3回洗浄します。

次に、インサートを傾け、基底膜に残っているメンテナンス培地を洗い流します。洗浄したインサートを新しい6ウェルプレートに移し、各組織の頂端面に滅菌済みの1%サポニン溶液を250 µL加えます。プレートをインキュベーターに戻し、10分間インキュベートします。

連続希釈用のチューブを準備し、各希釈チューブに 900 µL の PBSG を充填します。次に、P 1000 ピペットチップを用いて、組織を往復運動でメンブレンから擦り取り、続いて円を描くように動かしてインサートの端から組織を除去します。その後、滅菌済みの大口径 P 1000 ピペットチップを使用して、懸濁液を空の 1.5 mL エッペンドルフチューブに移します。

次に、インサートの頂端面に250 µLのDPBSを加え、倒立位相差顕微鏡でインサートを観察して、回収すべき組織が残っていないか確認します。懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、500 µLのDPBSを加えて激しく混合します。細胞懸濁液を1分間ボルテックスします。

次に、26ゲージの針を装着した滅菌済みの1 mLシリンジを使用します。針を通して懸濁液をシリンジ内に吸引します。気泡が入らないように注意しながら、懸濁液をゆっくりと3回針に通します。

その後、懸濁液をさらに1分間激しくボルテックスします。次に、大口径のピペットチップを使用して、懸濁液 100 µL を最初の希釈チューブに移します。チューブを5秒間激しくボルテックスし、10倍段階希釈を行い、希釈液をチョコレート寒天培地に滴下します。

その後、内部に取り込まれた細菌を回収するため、プレートを37 °C、5% carbon dioxideの条件下で一晩インキュベートし、生菌数を測定します。各インサートを200 µLのDPBSで3回洗浄します。底面の維持培地を100 µg/mLのゲンタマイシン硫酸塩を含む培地に交換し、さらに300 µLのゲンタマイシン含有維持培地を頂端面に添加します。

インサートをインキュベーターに戻して1時間静置し、その間にDPBSを予熱しておきます。次に、頂端面からゲンタマイシン含有維持培地を除去します。その後、インサートの頂端面と基底膜を予熱したDPBSで十分に洗浄します。

最後に、本図で示す内部移行した細菌の段階希釈および平板培養を行う前に、先ほど実演した洗浄および回収の手順を繰り返します。左側の非感染気道上皮組織と、右側のNTHI感染5日後の気道上皮組織の走査電子顕微鏡画像を比較します。NTHIとの長期共培養では、頂端組織に重大な損傷が生じないことが確認でき、気道上皮モデルの有用性が強調されています。

ここでは、上皮気道共培養中の時間経過に伴うNTHIの細胞内取り込み数を示すグラフを示します。R 2 8 6 6株を、1インサートあたり約1×10⁷ CFUで接種しました。その後、各指定の時間において細胞内にとり込まれた細菌を回収し、計数しました。

このビデオを視聴することで、A PREモデルを用いて、NTHIと初代ホルモン呼吸器組織の長期共培養を行う方法について十分に理解できるはずです。