放射性標識ドーパミンを用いたマウス脳シナプトソームのドーパミン取り込みの測定

ドーパミントランスポーター(DAT)を含むニューロンシナプスの無傷のシナプス前終末に由来する膜結合構造であるシナプトソームをマウスの脳から採取します。

試験管にリガンドを含む緩衝液を充填し、リガンドを含む緩衝液とDAT阻害剤を基準チューブに充填します。

シナプトソームを追加します。

リガンドはドーパミン分解酵素やその他のトランスポーターを阻害し、ドーパミン分解と非特異的取り込みを防ぎます。

標識なしおよび放射性標識ドーパミンを導入します。

テスト条件では、シナプトソームDATはドーパミンを取り込みます。

参照条件では、阻害剤はDATを介したドーパミン取り込みを妨げ、バックグラウンド取り込みのみを許可します。

シナプトソームを保持するマイクロファイバーフィルターにサンプルを追加します。

結合していないドーパミンを除去するために洗浄します。

フィルターをシンチレーションチューブに移します。

放射線感受性化合物を含むシンチレーション液を加える。

チューブをシンチレーションカウンターに置きます。

ドーパミンからの放射性放出は、化合物を興奮させて発光し、これはカウンターによって測定されます。

テストデータから基準を差し引いて、シナプトソームドーパミン取り込みを測定します。

このステップでは、440マイクロリットルの取り込み緩衝液、リガンド、およびコカインを12本の指定された1.5ミリリットル微量遠心チューブに加え、440マイクロリットルの取り込み緩衝液とリガンドを残りの36本の1.5ミリリットル微量遠心チューブに加えます。6本の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに10、5、2.5、1.25、0.62、および0.31としてラベルを付けます。次に、750マイクロリットルの取り込みバッファーとリガンドを、最も少ない数の5本の微量遠心チューブに加えます。

次に、1,455.4マイクロリットルの取り込みバッファーとリガンド、14.6マイクロリットルの非標識ドーパミン、および30マイクロリットルのトリチウム化ドーパミンを標識10のチューブに加えます。次に、750マイクロリットルの混合物を10とラベル付けされたチューブから5とラベル付けされたチューブに移します。よく混合し、750マイクロリットルの混合物をこのチューブから2.5とラベル付けされたチューブに移します。残りのチューブでこの希釈を繰り返します。

その後、ガラスマイクロファイバーフィルターを12ウェルフィルターバケットに置いた後、4ミリリットルの取り込みバッファーで事前にすすぎます。その後、10マイクロリットルのシナプトソーム膜懸濁液を、440マイクロリットルの緩衝液を含む最初の24本の1.5ミリリットル微量遠心チューブに加えます。慎重にボルテックスし、すぐにスピンダウンして、シナプトソームがバッファーに沈むようにします。

その後、摂氏37度で10分間放置します。10分後、最初の2カラムに10マイクロモルと5マイクロモルのドーパミン50マイクロリットルを加え、37°Cで5分間振とうしながら放置します。5分後、1ミリリットルの氷冷取り込みバッファーを加えて反応を停止します。2.5マイクロモルと1.25マイクロモルで繰り返し、次に0.62マイクロモルと0.31マイクロモルで繰り返します。

を事前にすすぎたマイクロファイバーフィルターに加え、5 x 4ミリリットルの氷冷取り込みバッファーで洗浄します。最初の12個のサンプルをフィルターに追加したら、フィルターをシンチレーションチューブに移動します。次の12個のサンプルでこれを繰り返します。シンチレーションチューブ49〜51の底にマイクロファイバーフィルターを置き、その上に最大ドーパミン10マイクロモル25マイクロリットルを加えて、最大計数チューブを3

この後、51本のシンチレーションチューブすべてをヒュームフードに1時間放置します。次に、各シンチレーションチューブに3ミリリットルのシンチレーション液を加え、シェーカーで1時間激しく振とうします。ベータカウンターでトリチウム化ドーパミンを1分間カウントするには、プログラムを開いて適切な設定を選択します。タンパク質の測定には、標準的なBCAタンパク質アッセイキットを使用して、調整のためのシナプトソームのタンパク質濃度を測定し、サンプル間の取り込みを適切に比較します。