同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

この手順の目的は、パッチクランプ法とパイロメトリー法を同時に用いてニューロンを電位固定し、DAT介在性のドパミン放出を測定することで、ドパミンの逆輸送を測定することです。まず、ドパミンを用いてパイロメトリック電極の健全性を確認します。次に、パイロメトリック電極を細胞の近くに配置し、パッチピペットを用いてニューロンのホールセルパッチを形成します。

次に、パッチピペットを用いて細胞の電位を制御しながら、細胞から放出されるDAT介在性のドーパミンをパイロメトリック電極で同時に記録します。最終ステップとして、DATブロッカーを添加し、全細胞電流とパイロメトリー電流を再度記録することで、ドーパミントランスポーターによって特異的に介在される電流を差し引くことができるようにします。この手法の意義は、ドーパミン作動性ニューロンの電位を制御しながら、ドーパミントランスポーターを介したドーパミンの逆輸送を測定できる点にあります。

同時パッチクランプおよび気圧測定記録システムには、システムのDC光源を生成するために、優れたDIC光学系と長作動距離レンズを備えた倒立顕微鏡が必要です。電気ノイズを低く抑えるため、顕微鏡の光源を自動車用バッテリーに接続します。本構成では、油圧マイクロマニピュレーターがノイズレベルにほとんど影響を与えないため、これを使用しています。

電位固定法によるホールセル記録には右手のマニピュレーターを、温度測定には左手のマニピュレーターを使用します。ホールセル記録用の電極を準備するために、P 2000 プラーを用いて石英ピペットを引きます。通常、抵抗値が 3〜4 MΩ のピペットを使用します。

次に、1 mMのドーパミンを含むピペット溶液を電極に充填します。その後、右側のマニピュレーターにあるピペットホルダーに電極を装着します。ドーパミン含有ピペット溶液を入れた容器は、必ずアルミホイルで包み、使用しないときは氷上に保持してください。

ドーパミンは酸化しやすいため、溶液を氷上に置き遮光して保存することで酸化速度を抑制できます。銀線を電極ホルダーに通し、次にamパラメトリックアダプターを電極ホルダーに取り付けます。続いて、銀線に接触する十分な量の水銀をtric電極に充填します。

電極をアダプターに取り付ける際は、必ず顕微鏡でpro CFE低ノイズカーボンファイバーおよびパラメトリック電極を検査し、チップが清潔で損傷していないことを確認してください。カーボンファイバーのチップを損傷から保護するため、必ずカーボンファイバーの端の方を持つようにしてください。その後、pro CFE Tric電極を取り付けます。

続いて、組み立てた電極を左側の油圧マニピュレーターに取り付け、tric電極の完全性を確認します。これを外部溶液の入ったガラス底ペトリ皿に浸します。ドーパミンがない状態でのベースライン電流を記録します。

次に、1 mMのドーパミン溶液を10 µL、ディッシュに添加します。良好なアンペロメトリック電極であれば、酸化電流の増加が記録されるはずです。実験の前後には、必ずアンペロメトリック電極の健全性を確認してください。

本手順では、ガラスボトムペトリ皿に入れたドパミン作動性ニューロン、またはドパミントランスポーターを発現するように構築された細胞をインキュベーターから取り出します。温めた外部溶液を用いて、細胞またはドパミン作動性ニューロンを3回静かに洗浄します。細胞を可視化して実験を行うために、ガラスボトムペトリ皿を顕微鏡ステージに設置し、細胞が鮮明に見えるように適切な焦点位置を探します。

次に、パッチ電極に正圧をかけます。1 mLシリンジを用い、マイクロマニピュレーターで両方の電極をゆっくりと溶液中に降ろし、細胞に近づけます。その後、アンプエロメトリック電極を細胞の左側に、パッチ電極を右側に配置します。

パッチ電極が細胞に接触したら、口またはシリンジを用いて軽く吸引し、細胞にギガシールを形成させます。その後、吸引によってシールを破裂させてホールセル構成とし、ドーパミンを含む内部溶液が細胞内に透析されるまで5〜8分間待ちます。

次に、ピペットを通じて保持電位-40 mVから-60 mVおよび+100 mVの間で細胞膜電位をステップさせ、DAT介在性電流を記録します。DAT介在性の特異的なドーパミンフラックスを決定するために、DATアンタゴニスト不在下および存在下での電流を記録します。特異的なDAT介在性電流は、アンタゴニストなしで記録された電流トレースから、DATアンタゴニスト存在下で記録されたトレースを差し引くことで決定されます。

トレース電流の上方への偏向は、ここで示されているドーパミンの外向きフラックスに対応しています。ホールセルパッチモードにて、2 mMのドーパミンを含むピペットを用い、保持電位-40 mVから-60 mVから+100 mVの間で膜電位を20 mV刻みでステップさせた際に記録されたDAT介在性電流です。ここでは、ホールセル電流と同時に取得されたアンペロメトリック電流を示します。

このビデオを視聴することで、電位固定法を用いたニューロンにおけるドパミントランスポーターによるドパミンの逆輸送の測定方法について十分に理解できるはずです。実験の前後にパラメトリック電極の完全性を確認すること、および、拮抗薬不在下で記録したトレースから拮抗薬存在下で記録したトレースを差し引くことを忘れないでください。