エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

本手順の全体的な目的は、マウス胚を液体窒素で凍結保存し、その後融解させて生存マウスを回収することである。具体的には、まずマウス胚を平衡化培地に浸し、次にクライオチューブ内のガラス化培地へと移し、その後液体窒素タンクに保存することでこれを達成する。その後、胚を高浸透圧培地で融解し、受容雌に移植するまで培養培地で培養する。

最終的に、ガラス化融解後の胚の生存率は90%を超え、胚移植後の出生率は30%から70%の間であることが結果に示されています。本手法の主な利点は、透過性凍結保存剤であるグリコールが、従来の凍結保存剤よりも胚に対する毒性が低いことです。本プロトコルの開始前に、私の研究室の技術者が手順を実演します。

自然交配または従来のIVF技術により得られた2細胞期のマウス胚2個を、最終的な保存用にクライオチューブに準備し、胚凍結溶液EF S 40を50 µL加えます。次に、35 mmまたは60 mmのプラスチック製ペトリ皿に、室温のEFS 20を50 µL準備します。

ガラスキャピラリーを用いて、最大30個の胚をディッシュに移します。この際、培養液が混入しないように注意してください。また、胚の脱水を防ぐため、液滴の底に配置してください。

約60〜90秒後、キャピラリーチューブを用いて脱水された胚を吸い上げます。胚は収縮した形態を呈しています。これらの胚をクライオチューブ内のEFS溶液に移動させ、その際、EFS 20の持ち込みを最小限に抑えます。

胚を移した後、液体窒素で凍結させる前に、EFS 40内で1分間静置させます。胚を融解させる前に、M 16培地などの高浸透圧胚培養液を10 µLずつ、培養皿に少なくとも2滴滴下します。次に、滴をシリコンオイルまたはミネラルオイルで完全に覆い、使用時まで二酸化炭素インキュベーター内に皿を保管します。

次に、フェイスマスクとクライオグローブを着用した状態で、TS one溶液を37 °Cに温めます。液体窒素タンクから胚を取り出します。速やかにクライオチューブを開け、液体窒素をタンクまたは適切な容器に廃棄します。

その後、30秒間待ちます。次に、温めたTS one溶液 850 µLをクライオチューブに加えます。溶液が均一に溶解するように、緩やかにピペッティングを10回ほど繰り返します。

その後、全量をプラスチック製の60 mmペトリ皿または時計皿に移します。胚が室温に慣れるまで3分間待ちます。胚は以降の操作の間、室温で保持してください。加温装置は使用しないでください。

ステレオ顕微鏡下でディッシュ内の胚を迅速に観察し、このインキュベーション開始時の状態を確認します。約2分間のインキュベーション後、培地がディッシュの表面全体に広がるまでディッシュを軽く揺すり、胚を沈めます。インキュベーションの最後の1分間に、TS two溶液を50 µLずつ3滴、別のディッシュに分注します。

3分が経過したら、実体顕微鏡を用いて胚がわずかに収縮したことを確認します。胚がまだ膨潤している場合は、さらに1〜3分間インキュベーションを継続してください。その後、ガラスキャピラリーで胚を回収し、TS twoの最初の滴に移します。

3分間待機し、胚を2滴目の液に転写します。続いて3滴目の液に転写します。最後に、インキュベーターに保管していた調製済みの胚培養液皿を取り出し、ガラスキャピラリーを用いて胚を培養液の1滴目に転写します。

実体顕微鏡下で観察すると、胚は徐々に正常な形態に回復するはずです。ここで、ディッシュをインキュベーターに戻し、約10分間静置します。その後、TS 2から持ち越されたスクロースを洗い流します。

胚を次の培養液のドロップへ移動させます。受容雌のucへ移植されるまで、CO2インキュベーター内で胚の培養を継続します。3つの異なるマウス系統から300〜480個の胚をガラス化保存し、その後回復させたところ、生存率は非常に高い結果となりました。

融解後、正常な形態を示した胚の割合は93〜99%であり、それらの胚のうち少なくとも84%が胚盤胞へと成長しました。液体窒素の取り扱いは極めて危険であるため、直接的な接触を避け、短距離での曝露を最小限に抑えるための予防措置を忘れないでください。窒素を取り扱う際は、常にこの手順に従ってください。