標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

この手順の全体的な目的は、インクジェットプリンティングを用いて細胞膜に一時的なポア（細孔）を作成することです。これは、まず標準的なインクジェットプリンターを改造することで達成されます。次に、バイオインクを充填できるように、市販のプリンターインクカートリッジを空にして洗浄します。

次に、目的の細胞を、蛍光タグ付きアクチンモノマーとPBSの溶液に懸濁させ、バイオインク溶液を作成します。最終ステップは、改造したプリンターとカートリッジを用いて、バイオインクを顕微鏡スライド上にプリントすることです。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、Fluor four結合Gアクチンモノマーが、一過性の膜孔を通じてプリントされた細胞内に取り込まれたことを示すことができます。

標準的なトランスフェクションや細胞マイクロインジェクション技術に対する本手法の主な利点は、このプリンティング技術が簡便であり、高い細胞生存率が得られることです。本手法は遺伝学的な知見を提供できるだけでなく、細胞生物物理学や組織工学などの他の研究分野にも応用可能です。また、本手法を用いることで、細胞遊走時の細胞骨格を容易に観察することができます。

この手法を考案したきっかけは、細胞に負荷をかけた際に生じる細胞骨格配列の変化を可視化したいと考えたことでした。まず、プリンターの底面にあるプラスチッククリップを外し、上部のプラスチックケースをゆっくりと持ち上げます。次に、ボタンディスプレイライトパネルをプリンター上部から取り外しますが、プリンターのマザーボードとの接続は維持したままにします。

キムワイプとエタノールを使用して、プリンター内部、特にインクカートリッジが設置される箇所と印刷が行われる箇所を清掃します。次に、HP DeskJet 500の給紙メカニズムに電力を供給しているケーブルを確認します。

それらはフロント側の左手、ペーパー trays のすぐ下にあります。マザーボードからケーブルを外してください。次に、用紙検知機構を確認し、用紙給紙機構の上部かつ後方にあるグレーのプラスチックレバーにワイヤーループを固定して手動ハンドルとして使用し、ここにステージを設置します。15本の遠心チューブ用フォーム製輸送ホルダーを用い、給紙機構前方の印刷領域に数枚の顕微鏡スライドをテープで固定して、目的の印刷用スライドをカートリッジプリントヘッドの直下の高さまで上げます。

最後に、無菌操作を維持するため、プリンターを層流クリーンベンチ内に配置します。まず、カートリッジをパッケージから取り出しますが、プリンター接点とプリントヘッドを覆っている保護テープはそのままにしておきます。ハンドヘルド回転カッティングツールを使用し、緑色の上面に障害物がない状態にして、カートリッジ本体をクランプで固定します。

カートリッジの緑色のトップ部分を切り取り、リザーバーに残っているインクをすべて出し切った後、プリンター接点とプリントヘッドを覆っているプラスチック製の保護テープを取り除きます。この操作中にプリントヘッドから水が漏れる可能性がありますが、カートリッジに影響はありません。水が透明になったら、カートリッジを乾燥させます。

クリーンな印刷環境を維持するため、まずカートリッジを脱イオン水で満たしたビーカーに完全に浸し、15分間超音波洗浄を行います。超音波洗浄後、カートリッジを取り出し、余分な水気を振り落とします。さらに、カートリッジ内に70% ethanolをスプレーし、より無菌的な環境を作ります。

目的の細胞を回収した後、15 mLのコニカルチューブ内で、新鮮な培地5 mLを用いて、室温、250 ×gで5分間遠心分離します。次に、培地を吸引除去し、新鮮に調製した蛍光G actinストック溶液を用いて、細胞密度1 × 10⁵ cells/mLで再懸濁します。バイオインクの作成についてですが、250 µLのバイオインクで、ここに示すラインパターンのカバーグラス3枚分をプリントできることに留意してください。プリンターの電源を入れてウォーミングアップさせた後、ここに希望のプリント面を配置します。あらかじめ組み立てたステージの中央に、22 mm × 22 mmのカバーグラスを使用します。

次に、描画ソフトを開き、希望のパターンを選択します。続いて、細胞懸濁液を約100〜120 µL、カートリッジコンパートメント底部の小さな円形ウェルにピペッティングします。プリンターが再び予熱される間にファイルを印刷すると、カートリッジが待機位置に移動します。

カートリッジがインクドリップウェルのわずか左側に移動し、そこで停止したとき、給紙メカニズムのワイヤーを上に引き上げると、印刷が開始されます。プリンターは、HP desk jet 500プリンターを用い、G actinモノマー溶液中の線維芽細胞懸濁液からなるバイオインクを使用して、印刷ステージの中央に配置されたカバーガラス上に印刷を行います。

HP 26シリーズを用いて、インクカートリッジ内の細胞をガラス製顕微鏡カバーガラス上にプリントしました。この図は、蛍光アクチンモノマーを取り込んだプリント後の線維芽細胞の代表的な結果を示しています。このパターンは、前の図において、顕微鏡スライドの大部分にわたってプリント溶液の連続線を作成するために使用されました。

この図では、バイオリミットと細胞が相互に配置された直線が示されています。印刷直後は、細胞が懸濁されているバイオリミット溶液に遊離した過剰な蛍光アクチンモノマーが含まれているため、背景蛍光が増加することに注意してください。印刷後、約10分間細胞をインキュベートすることでスライドへの接着が促進され、過剰なモノマー溶液を新鮮な増殖培地で基板から洗浄できるようになり、背景蛍光が大幅に減少します。ここでは、局所的な印刷領域に印刷された3T3線維芽細胞の代表的な画像を示します。印刷から15分後に撮影された細胞の蛍光顕微鏡写真では、G-アクチンが緑色に、核が青色に、そしてG-アクチンと核染色の重ね合わせ画像として示されています。

次の2枚の画像は、プリントから3時間後の、直線状に配置された2つの線維芽細胞の蛍光顕微鏡写真です。1枚目の画像は、細胞内の蛍光標識されたアクチンモノマーを示しています。2枚目の画像は、蛍光チャンネルと背景画像のオーバーレイであり、左下のスライド上にいくつかデブリが存在する可能性がありますが、それらは蛍光を発していないことを示しています。

最後に、蛍光タグ付きモノマーと共に3時間インキュベートした非プリント細胞のコントロール群を提示し、セルプリンティングによる膜透過なしにモノマーが細胞膜を透過できないことを示します。この手順を行う際は、プリンターの目詰まりが本手法の速度を低下させる要因となるため、予備のカートリッジを数本洗浄して準備しておくことが重要です。このビデオを視聴することで、標準的なデスクトッププリンターを生存細胞のプリント用に変換し、一過性の膜力（membrane force）を生成する方法について十分に理解できるはずです。