DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

本手順の全体的な目的は、亜硫酸塩変換後のDNAをゲノムシーケンシングすることにより、CpGジヌクレオチドのDNAメチル化解析を可能にすることです。まず、二本鎖DNAを変性させ、亜硫酸塩変換反応が行われるようにします。次に、亜硫酸塩による脱アミノ化により、ゲノムDNA中のすべての非メチル化シトシンをウラシルに変換します。

この反応は3つの段階で進行します。第一に、B亜硫酸塩が5-6位の二重結合に付加することで、シトシン残基のスルホン化が起こります。第二に、亜硫酸塩誘導体によるシトシンの加水分解的脱アミノ化により、亜硫酸塩誘導体によるSSLが生成されます。そして第三に、アルカリ処理によってスルホン酸基が除去されることで、SSL残基となります。

次に、重亜硫酸塩変換特異的プライマーとPCR増幅によって標的領域を増幅します。最終ステップでは、PCR産物のクローニングとシーケンシングを行い、DNA分子全体のメチル化について単一ヌクレオチドレベルの解像度で解析します。最終的に、酸性条件下での重亜硫酸脱アミノ化に対するシトシンと5-メチルシトシンの感受性の差を利用することで、ゲノムDNA中のCPGジヌクレオチドのDNAメチル化が示されます。

サザンブロット法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、DNAメチル化を単一ヌクレオチド分解能で解析できることです。この手法は、がんなどのヒト疾患におけるDNAメチル化の役割など、エピジェネティクス分野における重要な疑問の解明に役立ちます。DNAサンプルを重亜硫酸塩変換させる準備として、まず2 µgのゲノムDNAを、重亜硫酸塩およびDNA溶解バッファーとともに、総量18 µLとなるように加え、37 °Cで1時間インキュベートします。

次に、新しく調製した3 M水酸化ナトリウムを最終濃度が0.3 Mになるように2 µL加え、ゲノムDNAを変性させます。サンプルをウォーターバスで37 °Cで15分間インキュベートし、続いて90 °Cで2分間インキュベートします。ヒートブロックから取り出した後、直ちにチューブを氷上で5分間静置し、10,000 Gで10秒間遠心分離してDNAがチューブの底に集まるようにします。これで、次に実演するB細胞の脱アミノ化に使用する変性DNAサンプルの準備が完了しました。

硫酸抱合および加水分解的脱アミノ化反応を行う前に、10 millimolarのキノールおよび飽和亜硫酸水素ナトリウム（pH 5.0）の新鮮な溶液を調製します。亜硫酸水素ナトリウムは飽和溶液であるため、小さな塊が未溶解のまま残る場合があります。変性DNA 20 µLに、亜硫酸水素ナトリウム 208 µLとキノール 12 µLを加え、最終容量を240 µLとします。

チューブをボルテックスし、10秒間遠心分離して、すべての液滴がチューブの底に集まるようにします。サンプルの上にミネラルオイルを重ねます。変換するDNAの量と品質に応じて、ウォーターバスを用いて55 °Cで4時間から16時間インキュベートします。

酸化を防ぐため、重亜硫酸塩変換は暗所で行うことが重要です。適切なインキュベーション時間が経過した後、マイクロ遠心分離機でチューブを短時間遠心分離し、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。次に、ミネラルオイルを吸い込まないように注意しながら、チューブの底からDNA溶液を慎重にピペットで抽出します。

次のステップでは、当研究室ではPromega Wizard DNA cleanup systemを使用します。DNAサンプルに1 mLのレジンを加え、チューブを反転させて混合し、その後、脱塩カラムに取り付けたシリンジに溶液をピペットで移します。最後に、遊離した亜硫酸イオンを除去するため、亜硫酸処理したDNAを脱塩カラムに通し、50 µLのMilli Q水で溶出します。

次のステップでは、脱塩によってウラシル環から重亜硫酸塩のアドクトを除去します。これを行うため、重亜硫酸塩処理済みの各DNAサンプルに、最終濃度が0.3 Mとなるように、調製したばかりの3 M 水酸化ナトリウムを5.5 µL加えます。その後、サンプルを37 °Cで15分間インキュベートします。

サンプルを短時間遠心分離し、各サンプルに1 µLのTRNAを添加します。酢酸アンモニウムを最終濃度3 Mになるように加えて溶液を中和します。次に、エタノール沈殿によりDNAを回収します。

氷冷した100%エタノールを330 µL加え、転倒混和して十分に混ぜ合わせます。−20 °Cで1時間から一晩静置した後、4 °C、14,000 ×gで15分間遠心分離します。次に、上清を完全に除き、沈殿したDNAを約20分間風乾させます。

風乾後、ペレットはほとんど目視できなくなります。DNAペレットを50 µLの0.1 XTEまたは水で再懸濁し、室温で約2時間放置します。この間、時々チューブをボルテックスしてDNAが完全に溶解していることを確認し、その後、短時間遠心分離を行います。DNAが溶解したら、DNAの量と品質に応じて-20 °Cで1年から10年間保存するか、あるいはすぐに使用できます。PCR増幅において、プライマーの最適化はこの手順で最も困難な側面です。

したがって、プライマー設計を確実に成功させるために、以下のガイドラインを提示します。これらのガイドラインを説明するため、標的配列を亜硫酸塩変換しており、変換後のシトシンは青色のTとして、未変換のCpG部位は赤色のcgとして表記されています。特異性を確保するため、プライマーの長さは24〜30塩基対にする必要があります。また、プライマーの予測Tm値は50 °C以上で近似しており、その差が1〜2 °C以内に収まっている必要があります。

変換特異性を確保するため、プライマーにはCからTへの変換塩基を約25%含める必要があります。変換されたD-N-A-C-P-Gジヌクレオチドの増幅を確実にするため、3'末端の最終塩基はCからTへの変換部位であるべきです。メチル化、非メチル化、または未変換のテンプレートに対する潜在的なバイアスを避けるため、プライマー配列内でのCPGジヌクレオチドは避ける必要があります。ただし、避けられない場合は、変換されたDNAの非バイアスな増幅を確保するために、CPG部位のシトシンをYに置換してください。

最後に、必要に応じてPCR反応の特異性または感度を確保するために、ネステッドまたはセミネステッドプライマーセットを設計します。最適化のため、25 µLずつのPCR増幅反応混合液を調製します。各反応液には、亜硫酸塩変換ゲノムDNA、DPSプライマー、塩化マグネシウム、塩化カリウム、トリス塩酸塩 pH 8.3、およびポリメラーゼを含め、メチル化または非メチル化物質の増幅バイアスを検証します。

ビスルファイト変換による比例的なPCR増幅を確認するために、50%メチル化および非メチル化の完全ビスルファイト変換コントロールサンプルを使用します。特異的プライマーとPCR反応液を温度勾配サーモサイクラーに用意し、8〜10本のチューブにわたり、プライマーのTm値から±3 °Cの範囲で勾配反応を設定します。チューブをボルテックスし、サーモサイクラーにセットする前にマイクロ遠心機で短時間遠心分離します。この図は、50%メチル化DNAと非メチル化DNAの混合物を用いた温度勾配PCR増幅プロファイルのアガロースゲル電気泳動の結果を示しています。

PCR増幅産物およびTと記された2、5、8番目のレーンは、メチル化されたDNAのみを消化する制限酵素で処理されています。最適なPCR増幅条件であれば、メチル化および非メチル化の増幅産物がバイアスなく比例して増幅され、ここに見られるように、切断されたPCR産物と未切断のPCR産物が同量になります。バイアスのない増幅のための最適なサーモサイクリング条件は55.6 °Cです。重亜硫酸塩処理されたDNAの完全な変換は、未変換のDNAのみを消化するシトシン部位特異的酵素を用いた消化により、3、6、9番目のレーンで解析できます。

ここでは、3番目、6番目、および9番目のすべてのレーンにおいて切断されたDNAが認められないことから、完全な重亜硫酸塩DNA変換が行われたことが示されています。このリアルタイム解離プロットでは、完全メチル化DNA（ピンク色の線 M）と非メチル化DNA（緑色の線 U）がそれぞれ 82.9 °C および 86.9 °C で解離するコントロールの増幅と比較して、メチル化および非メチル化DNAが同等に混在していることが（赤オレンジ色の線 50 50 mix）示されています。これは、異なる分子が解離する温度に基づいた増幅バイアスが存在しないことを示しています。

重亜硫酸塩処理済みサンプルの増幅によって得られたPCR断片は、アガロースゲル電気泳動で可視化し、シーケンシングすることが可能です。ここに、3つの異なる細胞株のシーケンストレースを直接示しており、CpG部位を黄色でハイライトしています。細胞株Xは3つのCpG部位すべてで100%のメチル化を示しており、細胞株YおよびZは、ここに示されている重なり合ったGAシグナルからわかるように、さまざまな程度のメチル化を示しています。図4Aは、CpG部位を黄色でハイライトした3つの異なる細胞株のシーケンストレースです。

個々のクローンのダイレクトシーケンシング後、個々の分子のメチル化状態をビスルファイトマップに表にまとめることができます。メチル化の不均一性を視覚化するため、個々のCpG部位におけるメチル化密度を赤色で示しています。この代表的なビスルファイトマップは、サンプルのハイスループット定量メチル化解析の結果です。

Sequenome EpiTyper技術を用いることで、図5Aに示す例のように、メチル化シトシンの存在に応じた特異的なスペクトルを得ることができます。その後、サンプル内の比率の要約をエピグラムとして外挿することができ、それが図5Bに示されています。この例は、4つの異なる細胞株における各 CpG サイトのDNAメチル化率を示しています。最終的に、エピグラムの作成後、メチル化プロットの要約図（図5C）を導き出すことができます。この手法により、エピジェネティクス分野の研究者がDNAメチル化およびヒト疾患におけるその役割を探索する道が開かれました。