PDMSデバイスの作製と表面改質

私の名前はKen Kotzです。私はマサチューセッツ総合病院に affiliated な Bio MAs Resource Center のポストドクターです。私の主な研究プロジェクトは、マイクロ流体構造を備えた免疫親和性捕捉デバイスを用いて好中球を分離することです。

私たちは、後続のゲノム解析に用いるRNAを単離するために、国内5か所の異なる病院でこのデバイスを使用しています。基本的に、これはシリコンの上にSU-8フォトレジストのマスタを形成したものです。このマスタの上に2液性エラストマーであるPDMSを流し込み、PDMSで金型を形成します。

マスターモールドをケースから取り出し、ペトリ皿に入れます。マスターモールドをペトリ皿の底にテープで固定します。天秤を用いて、PDMS、硬化剤、およびベースレジンの混合物を計量します。

硬化剤と樹脂の比率は1：10です。通常、切り出したデバイスに対して、樹脂を20〜30 g、硬化剤を2〜3 gそれぞれ量り取ります。硬化剤と樹脂の両方を小型のウェーボートに注いだ後、標準的なプラスチック製のフォークを使用して2つを混合します。

硬化剤が樹脂内に均一に分散するように、激しく混合し、混合物を折りたたむように混ぜ合わせることが重要です。通常、2つの成分が十分に混合されたかどうかを確認します。気泡の数を確認することで、エラストマー全体に小さな気泡が均一に分散している状態を目指します。

次に、ペトリ皿に入れたSU-8マスターの上にPDMSを注ぎます。PDMSを載せたマスターを真空ベルジャーに入れ、チャンバー内を減圧して、混入した気泡を除去（脱気）します。通常、この脱気プロセスには30分から1時間かかります。

脱気後、真空チャンバーからデバイスを取り出し、65から80 °Cのオーブンに入れます。これらの温度における最小硬化時間は3〜6時間です。当研究室では、通常、デバイスをオーバーナイトでオーブンに放置しています。

通常、11番の外科用鋼製メスを使用します。シリコンマスターの端から約half a centimeter深く直線的に切り込みを入れ、マスターの縁に沿って切り出し、大きな円盤状にします。マスターからPDMSモールドを剥がし、構造面を上にして清潔なペトリ皿に置きます。

剥離させたモールドをペトリ皿から取り出し、ナイフまたはリニアレールに取り付けられたナイフを用いて、切断台の上に置きます。モールド上のデバイスを切断します。その後、切断された各デバイスを、さらなる処理のために再びペトリ皿に戻します。

通常、デバイスを流体と接続するために、PDMSデバイスに穴を開けます。穴あけに使用する器具は、標準的な3 mmシリンジです。この3 mmシリンジの先端には、鈍端のステンレス製針が装着されています。

ステンレス鋼製針の中には、針の内径に適合するワイヤーが入っています。そのワイヤーはシリンジのプランジャーに接続されています。プランジャーを引いて針を後退させることで、PDMSに穴を開けるか、プラグを打ち込むことができます。PDMSデバイスを裏返しにし、プランジャーを押して取り出します。

パンチデバイスを使用する際の秘訣は、プランジャーをできるだけ垂直に保ち、パンチデバイスを一切回転させないことです。PDMSに穴を開けた後、ピンセットでPDMSデバイス全体を持ち上げて裏返し、プランジャーを押し下げてプラグを排出します。その後、プラグをピンセットで掴んで廃棄します。

その後、プランジャーを再び引き戻し、デバイスを元の位置に伏せてから、パンチを抜き取ります。すべての穴が開くまでこの操作を繰り返します。次にボンディング工程についてですが、ここではPDMSデバイスをガラススライドに接合します。

本デバイスでは、PDMSをガラススライドに不可逆的に接合、または共有結合させます。この操作は、プラズマアッシャー内に配置し、反応性酸素プラズマにさらすことで行います。具体的な手順は、まずPDMSデバイスを取り出し、プラズマアッシャーのトレイに配置することから始めます。

デバイスの特徴的な面を上に向けた状態で、標準的なガラス製顕微鏡スライドをどのようなものでも使用できます。本デバイスには、わずかに大きい1.5インチの顕微鏡スライドを使用しています。これらはパッケージから出したままの状態で使用可能です。

ピラニア溶液による処理を行うことが推奨されます。これにより、ガラススライドの表面に付着している可能性のある有機汚染物質を除去できます。デバイスとガラススライドをプラズマアッシャー用のトレイの上に配置した後、トレイをプラズマアッシャー内にスライドさせ、反応性酸素プラズマにさらします。

プラズマアッシャーのプログラム完了後、チャンバーを開け、デバイスを載せたプレートをベンチトップに取り出します。ピンセットを使用して、接合面に指が触れないように注意しながら、PDMSデバイスを慎重に持ち上げます。接合面をガラススライドに向けて反転させ、PDMSとガラススライドの間に気泡が入っていないことを確認します。

ガラスに接合したPDMSデバイスを、より強固な化学結合を得るために、ホットプレート上で65〜75 °Cで10分間加熱します。このセクションでは、クリーンルームでの接合後、PDMSとガラスの表面を化学的に修飾します。これにより、表面に反応性OH基を持つPDMS表面が得られます。この反応性表面は親水性であり、最終的にはPDMSのバルク内部へと拡散します。

表面化学修飾はプラズマ処理の直後に行うのが最適であるため、5%の3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン溶液を使用します。これは容量比5%の溶液であり、基本的にはこれを入口から注入し、気泡が入らないようにデバイス内を完全に満たします。

気泡がある場合は、ピンセットで押し出して除去します。スライディング・ナン（slan）を注入した後、室温で15〜30分間静置します。通常、反応開始から10分後に2回目のslanを注入します。

シリンが約30分間反応した後、すべてのデバイスを3〜4デバイス容量の純エタノールでフラッシュします。排出された過剰分は、キムワイプで拭き取ります。デバイスを洗浄した後、デバイスを回収し、100 °Cに設定したホットプレートの上に置き、内部のエタノールを蒸発させます。これにより、シリン表面の封止（アニール）が促進されます。

デバイスが乾燥した後、デシケーター内で数ヶ月間保存するか、あるいは直ちに次のステップに進むことができます。デバイスのキュアリングが完了すると、ガラス面とPDMS面の両方にシランコーティングが施された状態になります。このシランはチオール基を持つキャプトシランであり、ヘテロ二機能性架橋剤であるGMBSと反応します。

これは純エタノールで希釈されています。水反応性があるため、水系条件にさらされないよう注意が必要です。デバイスに注入し、このようにピンセットで気泡を除去することで、すべての表面がこの分子で十分に覆われていることを確認します。

蓋をして30分間反応させます。GMBSを30分間反応させた後、デバイス内にあるエタノールの痕跡を取り除くため、脱イオン水でデバイスを洗浄します。その後、ビオチン結合タンパク質であるニュートラビンを流します。

次に、neutravainを10 µg/mLの濃度に希釈して準備します。誤ってデバイス内に空気が混入した場合は、すべての空気を効果的に除去するために、エタノールでデバイスを再度フラッシュする必要があります。エタノールはデバイス表面をより良く濡らすため、誤って混入した気泡を除去することができます。イオン水でフラッシュした後、通常は希釈したneutravain溶液をデバイス容量の2〜4倍量充填します。

Nutt travainは、Nutt travain上の任意の一次的な手段を通じて表面に固定化されたGMBSと反応します。このプロセスは、室温で1時間で行うことができます。通常、私はデバイスを4 °Cのコールドルームに一晩置きます。

しかし、抗体を添加する前に、溶液中で未結合の状態にあるAdenを洗い流す必要があります。これは、PBSで希釈した1% BSA溶液を流すことで行います。これらのチップは後続のゲノム解析に使用されるため、使用するすべての溶液はRNAフリーのものを使用します。

通常、デバイスを1% BSA溶液で4〜5倍量分フラッシュします。その後、抗体を添加します。本実験で使用する抗体はCD 66 Bであり、全血中の顆粒球に特異的な抗体です。

濃度は10〜25 µg/mLの範囲で使用し、抗体を注入します。各デバイスに計200 µLの抗体を注入します。デバイスの各ポートに100 µLずつ、2回に分けて注入します。

通常、一方のポートに100 µLを注入し、30分待機してから、反対側のポートにさらに100 µLを注入します。