ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

本実験の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚における選択された単一細胞の運命マッピングおよび系統追跡を行うことです。これは、ケージドフルオレセインを高分子量のデキストランに化学的に結合させることで達成されます。次に、調製したケージドフルオレセインデキストランをゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションし、その後、二光子吸収を用いて選択した細胞内で光活性化させます。

胚の光活性化後、活性化された細胞の運命マップを作成するために、免疫組織化学的解析を行い、アンケージド・フルオレセインデキストランを検出します。最終的に、この手法を用いることで、光活性化された単一細胞の系統寄与と組織内局在を特定することが可能です。標準的な蛍光顕微鏡法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、運命マップ作成のために単一細胞を差別的に標識できることです。

この手法は、未分化の前駆細胞がいかにして異なる組織型に寄与するかといった、発生生物学における重要な問いに答えるのに役立ちます。胚のマウンティングと光活性化のステップは、テキストによる説明だけでは習得が困難であるため、視覚的な実演が不可欠です。開始する前に、ケージドフルオレセインデキストランを合成し、アルミホイルで覆ったチューブに保存してください。その後、1〜2細胞期の胚に、合成したケージドフルオレセインデキストランをマイクロインジェクションします。

胚が適切な発生段階に達した後、コーティングを行います。次に、光活性化のため、コーティングした胚を低融点アガロースに封入します。アガロースが凝固したら、LSM 510 ソフトウェアをロードしてください。

白色光の光路に透明な黄色フィルターを配置し、「scan new image」を選択してから「start expert mode」をクリックします。「laser」タブを選択し、アルゴンイオンレーザーおよびMi.Taiレーザー光源をオンにします。Mi.Taiの波長を740 nmに設定します。

次に、「config」タブを選択します。アルゴンイオンおよびmi taiレーザーの光路構成を設定します。その後、「scan」タブを選択します。

対物レンズを20倍の0.8に切り替えます。Channelsタブで、「max set mode」メソッドをクリックして最大スキャン速度を設定し、数値をそれぞれ「line mean」と「one」に設定します。mi tai以外のすべてのレーザー光源の選択を解除してください。次に、パワーメーターを光ビーム光路に配置し、「con」ボタンを選択して連続スキャンを有効にします。

パワーメーターの平均レーザー出力が47 milliwattsとなるまで、透過率を調整します。次に、channelsタブにある停止ボタンを選択してスキャンを停止します。mi taiレーザー光源の選択を解除し、argonne ironを選択します。

次に、チャンネルタブにあるfast XYボタンを再度選択し、ピンホールを調整します。アルゴンイオンレーザーで最高の画質を得るために、検出ゲイン、アンプリファイア、オフセットを調整し、再度増幅させます。ステージコントローラーを使用して、活性化させる細胞を探してフォーカスを合わせ、停止ボタンをクリックします。クロップツールを使用して活性化細胞をクロップし、モードタブのクロップ係数が50から70の間になるように調整します。

次に、チャンネルタブにある停止ボタンを選択してスキャンを停止させます。モードタブでアルゴンイオンレーザーの選択を解除し、My Taiレーザーを選択します。スキャン速度を31.46 secondsに設定します。

次に、選択した細胞のケージドフルオレセインデキストランの2光子活性化スキャンを開始するために、シングルボタンを選択します。活性化後、「channels」タブに移動し、マルチタイレーザーの選択を解除して、アルゴンイオンレーザーを再度選択します。次に、「mode」の下で、ズーム係数を1に設定します。次へ。

「speed」の見出しにある「max」ボタンをクリックし、最高スキャン速度に設定します。光活性化領域を確認するには、「fast xy」を選択します。次に「channels」タブを選択してピンホールを調整し、再度検出を行い、光活性化領域がレーザーアブレーションされていないことを確認してください。

付属論文に記載されたプロトコルに従って、アンケージド・フルオレセイン・デキストラン免疫検出用の光活性化胚を調製します。胚をPBTで6回、APバッファーで2回洗浄します。その後、胚をAPバッファーが入った9ウェルプレートに移します。

次に、APバッファーを吸引し、N-B-T-B-C-I-Pを添加します。N-B-T-B-C-I-P溶液を吸引して、N-B-T-B-C-I-P染色の発色を停止させます。その後、胚をPBTで洗浄します。

次に胚を回収し、回転プラットフォーム上で室温で5分間振盪します。その後、PBTによる洗浄をさらに2回繰り返します。最後に、胚を0.6%低融点アガロースに封入し、正立型複合顕微鏡を用いて光活性化細胞の画像を撮影します。

この図では、光活性化前のケージドフルオレセインデキストラン鎖を微小注入したゼブラフィッシュ胚の明視野像（左）と蛍光像（右）を示しています。ここで示されているように、左の明視野像で矢印で示された体節の一つを、波長 740 nm、スキャン時間 31 s、平均レーザー出力 47 mW で光活性化させました。右の図では、光活性化後、ケージから解放されたフルオレセインデキストランによる蛍光が観察されます。

ケージド・フルオレセインデキストランの免疫染色の様子が、10ソマイト期の胚の側板中胚葉の狭い領域に示されています。前図と同様のレーザーパラメータを用いて光活性化を行い、免疫検出手順を実施しました。矢印で示された活性化領域は、本手順に従うことで、バックグラウンド染色を最小限に抑えて同定することが可能です。

ラベル化された細胞の局在や運命をより詳細に特性評価するために、異なる組織特異的マーカーを用いた免疫染色などの追加解析を行うことができます。この手法を用いることで、血管生物学分野の研究者が、発生中のゼブラフィッシュ胚における静脈前駆細胞から動脈への分化の起源を研究するための道が開かれます。NBTやBCIPなどの化学試薬を取り扱う際は、極めて有害な可能性があるため、常に手袋を着用することを忘れないでください。