胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

このビデオで示す方法は、卵割期のウニ胚の運命地図を利用して、単一の胞胚細胞を単離培養し、胚の分化が内因的な指令によるものか外因的な指令によるものかを評価するものです。まず、最初の卵割溝が動物極半球の淡色領域を二分している2細胞期の胚を回収します。これらの胚を培養し、胚が16〜32細胞期に達した時点で、卵膜を除去し、選択した細胞から隣接する細胞を解剖して取り除きます。その後、解剖した胞胚細胞をアガロースコーティングされた培養ウェルの窪みに移し、培養します。

外植片が目的の段階に達したら、これを回収し、in situ ハイブリダイゼーション、QPCR、または免疫組織化学を用いて遺伝子またはタンパク質の発現を評価します。培養や、大量の胚細胞あるいはオルガノイドを用いた他の手法と比較したこの技術の大きな利点は、リネージトレーシング研究によって分化運命が判明している単一の胚芽細胞を、増殖因子の添加や隣接細胞の存在なしに培養できる点にあります。したがって、細胞固有の因子がその細胞を特定の組織の前駆細胞へと誘導するのか、あるいは周囲の細胞からのシグナルが必要なのかを直接的に検証することが可能です。

Blairsの解剖および培養ウェルへの移送には、実体顕微鏡下での繊細な操作が必要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。本ビデオでは、母性由来のmRNAが細胞を神経分化へと誘導するかどうかを検証するために、この手法を用いて実体顕微鏡下での操作を実演します。Illumina社製研磨フィルムを用いて、4組のピンセットを研磨してください。

ピンセット1ペアは、手順中に先端が損傷した場合の予備として使用します。4本のピンセットすべてをオートクレーブし、滅菌容器に保管してください。0.1xおよび1.0xの修正バース生理食塩水（MBS）をそれぞれ500 milliliters作成し、フィルター滅菌します。これらの溶液は、ガラス製のスクリューキャップボトルに入れ、14 to 18 degrees Celsiusで数ヶ月間保存してください。100 millilitersの1X培地を用いて、2%の電気泳動グレード agarose を調製します。オートクレーブで agarose を溶解させ、次に使用する際は、agarose が液状である間に電子レンジで液状化させてください。

滅菌済みの24ウェル培養プレートの各ウェルの底に、約0.5 millilitersを注ぎます。これにより、インプラントがプラスチックに付着するのを防ぎます。次に、2〜360 millimeterのペトリ皿2枚の底に約2〜3 millilitersを注ぎ、軽く回して均一に分散させます。

これらは解剖皿として使用し、アガロースによって胚がプラスチックに付着するのを防ぎます。胚の膜を除去した後、アガロースが冷却され固まったら、6インチのパスツールピペットの先端を炎で加熱して球状に溶かします。その球状部分を短時間再加熱し、培養プレートのウェル内にあるアガロースの表面に軽く触れさせます。

これにより、X explanを配置するための浅い窪みが形成されます。プレートの各ウェルでこの操作を繰り返します。次に、培養プレートの各ウェルに、1 x 滅菌培養液を1 mLずつ満たします。

次に、胚盤胞の分離を容易にするため、解剖皿に 0.1 X MBS を満たします。解剖皿の準備が整ったら、ゼリーコートを除去した受精卵を 0.5 x 培養液を含む 100 millimeter ペトリ皿に移します。すぐに使用しないものは、最初の皿で 2 細胞期胚を確認している間に 14 degrees Celsius で培養しておくことができます。

解剖顕微鏡を用いて1枚目のペトリ皿内の胚を観察し、プラスチック製転送ピペットを使用して、約10個の1細胞期および2細胞期の胚を0.5x培養液を満たした別の皿に移します。ペトリ皿を14°Cのインキュベーターに入れます。このアッセイで細胞の発達能を正確に評価できるかどうかは、運命地図に基づいて正しい胚芽を切り出せるかにかかっています。

したがって、その後の正常な卵割パターンに従うことになる、2細胞期で正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが極めて重要です。ここに示されているように、正常な卵割はしばしば胚の一方の側でのみ起こります。

ドナー細胞が通常の側から由来している場合は、これらの胚を依然としてドナーとして使用できます。胚が2細胞期に達したとき、動物極にある淡色領域を最初の卵割溝が二分しているものを別のディッシュに分取します。この際、解剖する予定数の約5倍の胚を分取してください。これらが外植片（explan）のドナーとなります。

処置の間、残りの2細胞期胚をドナー胚の隣の別のディッシュに保持し、切除組織のステージングのための兄弟コントロールとして使用します。胚の選別と解剖が完了した後、インキュベーター内のディッシュに戻り、さらに1細胞期および2細胞期の胚を確認してください。1細胞期胚が分裂するまでに約90分かかるため、この操作は採卵後2時間まで行うことができます。

外植片を準備するために、5〜10個の胚を解剖皿に入れます。次に、透明な卵黄膜をピンセットで把持できるように最初の胚を配置します。卵黄膜は通常、目視できませんが、胚の表面の上に透明な空間があり、膜が離れている動物極において把持することが可能です。

片手の鋭利なピンセットで、切開する胚盤胞を傷つけないよう、胚盤胞から離れた位置を把持します。次に、もう片方の手の鋭利なピンセットで、もう一方のピンセットの先端に近い膜を把持し、ゆっくりと反対方向に引っ張って膜を剥がします。膜が除去されると、胚は平坦になります。

次に、ピンセットで隣接する細胞を掴み、この細胞をハンドルとして利用します。これにより、もう一方の手のピンセットで切除対象の細胞に直接触れることを避けながら、目的の細胞から残りの隣接細胞を穏やかに引き離します。同じ運命を共有する正中線の細胞を標的にする場合は、ペアとしてまとめて除去することができます。最後に、ハンドルとして使用した細胞を切除します。

滅菌済みのガラス製パスツールピペットを用いて、気泡の混入や過剰な吸引を避けながら、ブラストメア（胚盤胞）または2細胞期胚を吸い上げます。パスツールピペットの先端をX-ploran培養ディッシュのウェル内の培地表面下に配置し、ゆっくりとブラストメアを吐出させます。これにより、重力によって浅い窪みの中へ滑り込ませます。

複数の胚から採取した blastomere を、培養液の同じ窪みに配置することで、1つの explan にまとめることができます。解剖皿に残っている胚に対しても、この手順を1つずつ繰り返します。約10個の胚を処理すると、解剖皿が細胞の残渣で満たされます。

この状態になった場合は、次の解剖皿に交換してください。すべての解剖が完了した後、外植片が浅いくぼみの中にあるか確認します。入っていない場合は、70% Ethanolで滅菌し風乾させたヘアループを用いて、外植片をそっとくぼみの中へ押し込みます。最後の解剖後、インプラントをベンチ上の室温で約1時間インキュベートしてください。

滅菌済みのガラスパストゥールピペットを用いて、治癒した外植片の周囲にあるデブリを除去します。外植片のプレートを14〜20°Cで、対照群となる兄弟胚が入ったペトリ皿の隣に配置します。兄弟胚によって、芽基外植片の発達段階を確認します。

培養開始から約1〜2時間後、摘出した割球は約4回分裂し、損傷した隣接細胞から残ったデブリの大部分が脱落します。20時間後には、それらは小さく丈夫な細胞塊を形成します。兄弟細胞が目的の発達段階に達したら、外植片を回収してください。

これらの外植片は、一部の細胞が崩壊した場合でも、かなり良好に生存します。したがって、培養液中に混濁した塊がある場合は、白金耳やピンセットを用いて探索し、内部に健康な外植片が埋まっていないかを確認してください。ガラスパステルのピペットを用いて少量の培養液とともに外植片を回収し、実施するアッセイに適した固定液または溶解バッファーに静かに排出します。

16細胞期の背側または腹側のblasphemersを2個ずつ摘出し、兄弟胚が神経板初期段階に達するまで、14 °CのXMBS中で培養した。各サンプルについて、in situ hybridizationにより接合子神経板遺伝子Sox2の発現を解析した。青色の反応産物がその発現を示している。

本アッセイの結果は、神経板の前駆細胞である背側動物極の細胞の大部分が、SOX2を自律的に発現できることを示しています。つまり、胚の他の領域からの追加のシグナル伝達がなくとも発現可能です。SOX2を発現しなかった細胞については、解剖時に誤って同定された可能性があります。

対照的に、腹側表皮の前駆細胞である腹側動物極ブラスフェマー（animal blasphemers）のいずれもSOX twoを発現していません。これらのデータは、背側動物極ブラスフェマーが神経組織を形成する固有の能力を持つ一方で、腹側動物極ブラスフェマーにはその能力がないことを示しています。また、背側エクスプラン（explan）の一部では、背側中胚葉の形成を示す形態的な伸長も見られました。

これらの割球は、正常な胚において神経管を形成しますが、外植え培養を行い神経管マーカータンパク質を発現させることで、母性発現神経遺伝子の内因性レベルを変化させた際の影響を検証します。Fox D5 mRNAを8細胞期の腹側前駆割球に注入しました。ここで示されているように、腹側移植片の大部分がSOX2を発現しました。

逆に、8細胞期の背側前駆細胞芽（blastomere）にアンチセンス・モルフォリノ・オリゴヌクレオチドを注入してFox D5の内在性レベルを低下させると、SOX2を発現した背側外胚葉はわずかでした。これらの実験は、Fox D5の母性発現が、背側前駆細胞芽が神経運命を獲得する固有の能力において役割を果たしていることを示しています。この手順以外にも、機能獲得のためのmRNAや機能喪失のためのアンチセンス・モルフォリノ・オリゴヌクレオチドを、後に解剖する胚に注入するといった他の手法を用いることで、さらなる疑問を解消することが可能です。

例えば、細胞が特定の分化運命を辿るという固有の能力には、どのような遺伝子が関与しているのでしょうか。さらに、精製した因子を培養液に添加することで、既知のシグナル因子の機能を検証することも可能です。この手法は、個々の blastomere を完全な胚の新しい位置へ移植するためにも利用できます。

この試験は、移植された細胞が元々の発生運命に固定されているかどうかを確認するものであり、この情報は、多能性を持つ胚細胞が特定の組織の前駆細胞へと分化決定される細胞メカニズムを定義する上で極めて重要です。