カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

本カットローディング実験の全体的な目的は、制御された照明条件下において、無傷の網膜内のニューロン間におけるギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べることです。まず、細胞膜は通過せず、開いたギャップ結合チャネルを介して拡散可能なトレーサー分子であるニューロビオチンの溶液に浸した鋭利な刃で網膜を切断します。次に、網膜をリンガー液中でインキュベートし、開いたギャップ結合チャネルを通じてトレーサーを拡散させます。

ギャップ結合のカップリングが弱い場合、ニューロビオチンの蛍光は切断部位の近くにある網膜ニューロンに限定されます。対照的に、ギャップ結合のカップリングが強い場合は、切断部位から離れた網膜ニューロンでも蛍光が検出されます。既存の技術と比較してカットローディング（cut loading）の主な利点は、無傷の網膜神経組織において、細胞体が小さいニューロンに対しても容易に実施できる点にあります。

また、切片のロード中の照明条件の制御は、無傷の網膜組織における単一ニューロンの電気生理学的研究での制御よりも容易です。電気記録に使用される光刺激自体がギャップ結合のカップリングに変化をもたらす可能性があるため、この手法を実演するのは私の研究室のポストドクターであるDr.Chu Choiです。この手順では、手術前の少なくとも1時間、金魚を日中の完全暗黒下で保持します。また、網膜組織を固定するまでの以降のすべての手順も、日中の完全暗黒下で行います。水槽の水に150 milligrams per literのmethanesulfonateを添加し、金魚を深く麻酔させます。

その後、連邦および大学のガイドラインに従って金魚を安楽死させ、眼球を慎重に取り出します。次に、各眼球の前部を取り除きます。続いて、眼球の後部の上にフィルターペーパーを置き、フィルターペーパーと眼球を反転させ、フィルターペーパーが眼球の後部の下にくるようにします。

次に、暗順応させたキンギョの眼球から、強膜および色素上皮を含む眼球後部を慎重に取り除きます。細い鋏を用いて、網膜の視神経を切断します。眼球摘出前に、光受容体側を上にして配置したキンギョの神経網膜をフィルターペーパーに固定します。その後、眼球後部から無傷の神経網膜を切り出し、6ウェルプレートの各ウェルに、試験薬の有無にかかわらず、炭酸緩衝リンゲル液で酸素化した5 mLの溶液を加えて麻酔状態で保持します。

常暗条件下で、網膜をウェルに転移させます。次に、パラフィルムでウェルを密閉し、組織を30分間インキュベートします。網膜の切断直前に、0.5% neuro biotinをリンガー液に溶解させ、100 µLのトレーサー溶液を調製します。

次に、ニューロビオチン溶液をガラス製ペトリ皿に入れます。続いて、網膜が付着しているフィルターペーパーをペーパータオルの上で軽く叩きます。余分なリンガー液を取り除くため、カミソリの刃をニューロビオチン溶液に浸し、網膜とフィルターペーパーを垂直に放射状に切断します。

その後、カミソリの刃を再びneuro biotin溶液に浸し、網膜を2回目に切開します。この操作を網膜1個あたり最大4回まで繰り返します。この段階で、網膜を新鮮なリンガー液（試験薬を含む、または含まない培地）に移し、 loadingと拡散のために15分間静置します。

新鮮なリンガー液（被験薬を含むか、または含まない培地）で3回、各5分間洗浄します。次に、室温で0.1 Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒドを用いて、網膜を1時間固定します。その後、網膜を0.1 M PBSで4°Cにて一晩洗浄し、翌日に冷蔵庫から取り出します。

0.1 M PBSおよび0.3% Triton X 100を用いて、2% streptavidin Alexa 488を最終濃度10 µg/mLになるように調製し、網膜と反応させ、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、室温にて0.1 M PBSで網膜を3回、各回10分間洗浄します。

PBSを用いて、フィルターペーパーから網膜を剥離します。次に、細筆を使用して、網膜の光受容体側を上にして、Vector Shield封入剤を塗布したスライドガラス上に固定します。スライドを共焦点レーザー走査顕微鏡に移し、すべての実験条件において同一の倍率、解像度、および設定で撮影し、ギャップ結合による機能性トレーサーの共役範囲に対する異なる実験条件の影響を比較できるようにします。

これは、定常暗黒下における日中の光受容体細胞トレーサー結合の範囲を、選択的ドーパミン D2 受容体アンタゴニスト存在下での定常暗黒下における日中と比較したものです。両方の画像において、切断面は左側にあることに注意してください。単一の画像ですべての標識細胞が含まれている場合もありますが、関心領域の Z スタックを収集し、それを提示されたような単一の画像に投影（collapsed）させることを推奨します。

Zack（ザック）を順次追っていく際の、光受容体細胞トレーサー結合の範囲がこちらです。この画像では、カミソリによる切断面が右側にあることに注意してください。LSM画像ブラウザでトレーサー結合の範囲を定量化するには、画像を開き、エクスポートをクリックして、画像をTIF 16bit非圧縮ファイルとして保存してください。NIH Image Jソフトウェアを使用して、このTIFF画像にスケールバーを含める必要があります。

ホールマウント網膜の低倍率画像から、Alexa 488で標識されたニューロビオチンの蛍光強度を測定します。Image Jソフトウェアを使用してTIFFファイルを開き、スケールバーに対応する直線を描きます。次に、[Analyze]から[Set Scale]を選択し、既知の距離と長さの単位を入力します。

次に「OK」をクリックします。これで、蛍光測定値をミリメートルなどの校正済み単位で表示できます。その後、矩形選択ツールを使用して、関心領域を選択します。

蛍光のピークが選択範囲の左端に来るように配置してください。右端付近に蛍光信号がないことを確認します。「analyze and plot profile」をクリックし、恒常暗黒下で得られた昼間コントロールデータの解析とプロットを行ってください。

左から右に向かって指数関数的に減衰する曲線が表示されます。次に、ポップアップウィンドウのコピーをクリックし、Excelに貼り付けます。これで、切断部位からの距離を示す列と、切断部位からの距離の関数として蛍光強度を示す列の2つの列が作成されます。

比較として、日中に定常暗黒下で得られたデータを用いて、上記の手順を繰り返します。spit broが存在する場合、各生の蛍光値を最大蛍光値で除し、相対蛍光強度を算出します。切断部位からの距離と相対蛍光強度に対応する2つの列をコピーし、Originソフトウェアに貼り付けます。

これらの手順は、昼間のコントロール群と昼間の刺激群の両方について示されています。この時点でのランデータを、指数関数的減衰の1次関数を用いてフィッティングさせます。T検定またはANOVAを用いて、異なる実験条件下における空間定数の値を比較してください。

昼間のコントロール、昼間のpip rone、および夜間のコントロールデータの指数関数および統計解析を比較のために示します。ここでは、カットローディング法により明らかになった、暗適応させたキンギョ網膜における光受容体細胞トレーサーカップリングの程度を、昼間（A）、夜間（B）、および選択的ドパミンD2受容体拮抗剤存在下の昼間に例示しています。比較のため、すべての共焦点画像は同一の設定で撮影されました。

このグラフでは、3つの実験条件における蛍光強度が切断部位からの距離の関数としてプロットされ、指数関数によってフィッティングされています。カットローディング法（cut loading technique）を用いて、ここに示されている3つの実験条件における空間定数の値を算出することで、ギャップ結合を介したトレーサーの共役の程度を定量化します。また、カットローディング法は、網膜における他の細胞種間や、他種の電気シナプスの調査にも利用可能です。

例えば、これら2つの図は、暗適応条件下において、ウサギのA型およびB型の水平細胞が、カットローディング法によるニューロビオチンの導入と拡散に続き、相同的なトレーサー結合を示すことを例示しています。我々は、昼夜における桿体細胞と錐体細胞間のギャップ結合を介したトレーサー拡散の程度を調べるために、このカットローディング法を用いてきました。さらに、この手法は、他の網膜ニューロン間のトレーサー結合が網膜時計や特定の明暗条件によって制御されているかどうかを判定するためにも利用可能です。

また、他の脳領域におけるニューロン間のトレーサカップリングの研究にも使用できます。