小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

本実験の全体的な目的は、低分子化合物による誘導を用いて、多能性ヒト胚性幹細胞から直接的かつ排他的に神経細胞系譜を分化させることです。これは、規定の条件下で維持された未分化細胞にレチノイン酸を添加することで達成されます。次に、細胞を剥離させて浮遊培養へと移行し、そこで神経芽細胞と呼ばれる浮遊細胞クラスターを形成させることで、分化プロセスを継続させます。

神経芽細胞を神経分化培地を用いて組織培養プレートに接着させると、成熟神経細胞の特性を持つようになります。最終的に、免疫蛍光染色とデコンボリューション顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いることで、レチノイン酸処理がヒト胚性幹細胞の形態およびマーカー発現に及ぼす影響を示すことができます。他の手法では、ごく一部の細胞しか神経細胞の表現型を示しませんが、本手法では、低分子化合物を単純に添加することで、多能性ヒト胚性幹細胞を神経系 lineage へと効率的かつ高度に制御して誘導することが可能です。

ストック溶液を調製する際、注意すべき点がいくつかあります。Matrigelとヒトラミニンは、-80°Cから4°Cまで一晩かけてゆっくりと融解させてください。培地は4°Cで保存し、使用前には必ず37°Cに温めてください。また、ヒトESL培地を調製する場合、一部のサプリメントは使用直前に添加します。

これらには、BFGF、アスコルビン酸、活性ヒトインスリンA、およびトランスフェリンが含まれます。次に、プレートのコーティング直前に、Matrigelまたはヒトラミニンのワーキングソリューションを調製します。ゼラチンでプレコートした組織培養プレートの準備が完了後、プレートを37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。

ゼラチンは、Matrigelまたはラミニン作動溶液で代用可能です。これらのプレートを4°Cで一晩インキュベートしてコーティングします。まず、ヒトES細胞コロニーを5〜7日間培養し、その後、継代の準備を行います。

未分化のヒトES細胞のコロニーは、通常、細胞が積み重なり、境界が明確でわずかに不透明な外観を呈します。分化が進んだ細胞を主とするコロニーは、通常、透明に görünえます。また、分化が始まりつつあるコロニーは、通常、白色に見えます。白色または透明のコロニーは選択しないでください。75%以上の未分化細胞を含むコロニーを選択してください。

プレートを光にかざし、マーカーを用いて、プレート底面のわずかに不透明なコロニーの周囲を縁取りします。滅菌済みのP2ピペットチップの端を使用して、ヒトES細胞コロニーから周囲の線維芽細胞層を剥離させます。その後、周囲の線維芽細胞を除去し、あわせてコロニーの分化した部分もすべて除去します。

次に、分離した分化細胞を含む古い培地を吸引して取り除きます。続いて、各ウェルの未分化細胞をBFGFを含まないヒトE es細胞培地で1回洗浄し、使用直前にbFGFを添加した新鮮なヒトESL培地を3 mL加えます。次に、滅菌済みのP2ピペットチップを用いてコロニーを細かく切り、プレートから剥離させます。

分離したコロニー片を培地とともに50 milliliterのコニカルチューブに回収します。さらに、ウェルあたり1 milliliterの培地で洗浄します。

細胞は、低分子化合物を用いたさらなる分化誘導が可能な状態になりました。まず、コーティングした直後のプレートを37°Cに温めます。プレートからコーティング溶液を吸引し、コロニー片を含む培地を4 mLずつ各ウェルに分注した後、プレートを揺らさないように注意してインキュベーターに移します。

プレートを動かさず、細胞を定着させます。3日間の定着後、オミック酸を含む新しい培地を調製します。次に、細胞が浸った状態を維持する程度の量だけ残し、古い培地の大部分を除去します。

各ウェルの細胞が乾燥しないように注意してください。bFGFとレチノイン酸を含む新鮮なヒトES細胞培地を4 mL添加します。培地を隔日で交換し、レチノイン酸で処理したヒトES細胞コロニーを増殖させます。

7〜8日後、細胞は形態変化を起こし、大きな分化細胞になります。次に、浮遊細胞培養の作製に進みます。浮遊培養を開始するには、自発的に分化し、遊走して線維芽細胞層を形成した細胞からESLコロニーを剥離させます。前述の手法を用いて滅菌済みのピペットチップで操作し、浮遊した剥離線維芽細胞を含む古い培地を吸引除去してください。

細胞をHESC mediaで1回洗浄し、3 mLのHESC mediaに再懸濁します。次に、滅菌済みのP2ピペットチップを使用して、コロニーを小さく切り分け、プレートから剥離させます。

分離したコロニーを含む培地を、1本の50 milliliterコニカルチューブに回収します。ウェルを1 milliliterの培地で洗浄し、その洗浄液を回収分に加えます。次に、プールした細胞を4 milliliterずつ、6ウェル超低接着プレートの各ウェルに分注し、インキュベーター内で4〜5日間培養します。

この間に、浮遊した細胞クラスターまたは神経芽細胞が形成され、神経芽細胞がさらに成熟したニューロン表現型へと進展します。これらを含む培地を 50 mL コニカルチューブに回収します。その後、細胞を 1,400 RPM で 5 分間遠心分離します。

古い培地を可能な限り吸引して重量を測定し、同量のVEGF N NT threeおよびBDNFを含む新鮮なNSC培地を加えます。ピペッティングによって細胞を懸濁させ、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに懸濁液を4 mLずつ分注します。その後、プレートを37 °Cの加湿インキュベーターに移します。

ニューロブラストをMatrigelまたはヒトラミネートを含むニューロブラスト懸濁液とともに培養プレートに播種し、一晩置いて3D培養を行います。3Dマトリックスは37°Cで重合します。培地は1日おきに交換してください。

2週間以内に、神経突起を持つ神経細胞と色素細胞の広範なネットワークが出現します。これは、定義された培養システムで維持されたヒトES細胞が、多能性から神経外胚葉表現型へと排他的に移行させるのに十分なレチノイン酸が作用したことを示しています。未分化なヒトES細胞をレチノイン酸に曝露すると、コロニー内のすべての細胞が形態的に変化し、多能性関連マーカーであるOCT fourの発現を停止した大きな分化細胞となりました。また、これらの細胞はHNK one a、P two、TRKCなどの様々な神経外胚葉関連マーカーの発現を開始しました。

これらの大きな分化した細胞は増殖を続け、コロニーは次第に大きくなり、早期ニューロンマーカーであるbeta three tubulinを自発的に発現しました。より成熟したニューロンマーカーであるmap twoは、細胞が蓄積したコロニーの領域に現れ始めました。同時に、神経外胚葉細胞の出現に伴い、ドーパミン作動性ニューロンの分化およびチロシン水酸化酵素遺伝子の活性化に関与するニューロン特異的転写因子NER oneが核内へ移行しました。

剥離後、レチノイン酸処理を施したヒトES細胞は、bFGFを除去することで懸濁培養中で神経芽細胞を形成しました。神経芽細胞を組織培養プレートに接着させたところ、CNSに特有の、神経突起を持つ神経細胞および色素細胞の広範なネットワークが劇的に効率よく出現し、3か月以上にわたって培養することができました。これらのヒトES細胞由来の神経細胞は、レチノイン酸処理のない細胞の自然な多系統分化と比較して、beta three tubulinを発現し、さらにmap twoを共発現していました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、多能性ヒト胚性幹細胞から神経前駆細胞および神経細胞を約4週間で均一に作製することが可能です。

ヒト細胞の取り扱いは極めて危険である可能性があるため、本手順を実施する前に、細胞株に病原体やマイコプラズマが混入していないことを確認するなど、常に適切な予防措置を講じてください。