ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

iPS細胞から作製したBMECは、血液脳関門の機能と機能障害を研究するための新しい実験モデルを提供します。このプロトコルを使用して、BMECが膨張および凍結保存後もバリア特性を保持しているかどうかを調べました。この技術により、血液脳関門の破壊が疾患の病態生理学に関与する障害を持つ患者から、疾患特異的なBMECを生成することができます。

ヒトiPS細胞からのBMEC分化を誘導するには、コンフルエントなiPS細胞培養物をDPBSで1回洗浄してから、細胞を適切な量の酵素EDTAと37°Cで約5分間インキュベートします。単一細胞懸濁液が得られたら、遠心分離により細胞を回収し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した適切な量の幹細胞培地にペレットを再懸濁してカウントします。細胞を1立方センチメートルの濃度あたり10の10倍の濃度に希釈し、2ミリリットルの細胞を6ウェルの平底の個々のウェルに播種します。

細胞培養インキュベーターで24時間後、各ウェルの上清をE6培地と交換し、プレートをさらに4日間インキュベーターに戻します。iPS細胞由来BMECを精製するには、ウェルごとに調製したばかりのIV型コラーゲンとフィブロネクチン溶液を適量で培養プレートにコーティングし、プレートを摂氏37度で最低2時間インキュベートします。分化の6日目に、遠心分離によって細胞を収集し、B27、塩基性線維芽細胞成長因子、およびレチノイン酸を添加した新鮮なヒト内皮無血清培地の適切な量にペレットを再懸濁します。

TEER分析では、分化した細胞をコラーゲンとフィブロネクチンでコーティングした12トランスウェルフィルタープレートの各ウェルにプレートします。排出トランスポーター活性解析のために、コラーゲンとフィブロネクチンでコーティングされた24ウェル平底プレートの各ウェルに細胞をプレート化します。継代培養の24時間後、各ウェルの上清を、B27サプリメントのみを補充した新鮮なヒト内皮無血清培地と交換します。

TEERを使用してBMECの血液脳関門特性を測定するには、TEER機器を一晩充電し、機器と箸電極を70%エタノールで軽く拭いてから、安全フードに入れます。電源を入れ、メーカーの仕様に従ってオームメーターを校正します。電極を差し込み、70%エタノールで1回、DPBSで1回ですすいでください。

電極の短い方の端をインサートの非定型チャンバーに入れ、長い方の端をブランクウェルの基底外側チャンバーに入れます。負の制御応答を測定した後、実証されているように電極を迅速にすすぎ、最初の実験井戸を測定します。すべての測定値が記録されたら、箸の電極を再度すすぎ、電極をやさしく拭いて、安全フードで自然乾燥させます。

細胞の排出トランスポーター活性を評価するために、培養の8日目に、適切な数のウェルを10マイクロモルの排出トランスポーター阻害剤溶液で処理し、摂氏37度で1時間インキュベーターに入れます。インキュベーションの終了時に、インキュベーター内で10マイクロモルの排出トランスポーター基質溶液で細胞を1時間処理します。インキュベーションの終了時に、各ウェルをウェルあたり500マイクロリットルのDPBSで2回洗浄してから、ウェルあたり5%Triton-Xを添加した500マイクロリットルのDPBSで細胞を溶解します。

5分後、マイクロプレートリーダーを使用して、485ナノメートルの励起と530ナノメートルの発光で溶解した細胞の蛍光を測定します。トランスポーターアッセイで使用しないウェルについては、細胞をDPBSで2回洗浄してから、細胞核あたり4%パラホルムアルデヒドで定量します。E6培地で1日培養すると、細胞の形態はiPS細胞と似ています。

4日目までに、細胞はiPS細胞とは明らかに異なり、ウェルの大部分を覆っています。ヒト内皮無血清培地で2日間培養すると、細胞内に細長い丸石の外観が誘発されます。8日目には、個々の細胞は大部分が大きな丸石のパターンを形成します。

iPS細胞由来BMECの血管新生能を実証するために、スプラウトアッセイを実施することができます。これにより、成長因子治療の3日後にチューブ状構造が発達します。このプロトコールを用いて作製したiPSC由来BMECは、脳、肺、肝臓、腎臓の内皮細胞に発現するタイトジャンクションタンパク質と、血液脳関門に発現する血管内皮マーカーを共発現させました。

観察されたように、継代培養および培地変更の48時間後、iPS細胞由来BMECは、ラット初代アストロサイトと共培養したiPS細胞由来BMECについて記載された範囲内のTEER値を示しています。この段階では、排出トランスポーターの活性も観察されました。凍結保存後、TEERの測定値は、新たに得られたBMECと比較して低くなります。

ウェスタンブロット解析では、オクルージンなどのタイトジャンクションマーカーのレベルが低下していることが明らかになり、免疫細胞化学ではタイトジャンクションタンパク質のそばかすや擦り切れたパターンが示されています。iPS細胞の密度が高すぎたり低すぎたりすると、分化効率に影響が及び、適切な血液脳関門特性の発現に影響を及ぼします。この方法により、個別化されたBMECを使用してバリア特性、細胞シグナル伝達、およびトランスポーター活性の調査が可能になり、血液脳関門機能の生理学および病態生理学をモデル化できます。