植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

本実験の全体的な目的は、細胞レベルでのmRNA発現パターンを高感度かつ高特異的に可視化することである。これは、まずホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織切片を一連の溶液に通して、ワックスを除去し、組織を透過させ、バックグラウンド信号の原因となる組織内の正電荷を持つマイナーグループをブロックすることによって達成される。その後、標的遺伝子に特異的なDIG標識RNAプローブを組織切片に浸透させ、スライドを overnight でハイブリダイゼーションさせる。

次に、スライドをRNAで処理します。切片から非特異的に結合したプローブを除去した後、抗DIG抗体とともにインキュベートします。これにより、比色化学反応によってハイブリダイズしたプローブを可視化することが可能になります。

結果として、標的遺伝子が発現している組織内の細胞においてのみ、光学顕微鏡で検出可能な濃い青色のシグナルが認められます。RT-PCR、マイクロアレイ、または次世代シーケンシングなどの他の発現解析手法と比較した本手法の主な利点は、ここで示したin situハイブリダイゼーションプロトコルにより、標的遺伝子の発現パターンを組織学的コンテキストの中で明らかにできることです。これらの手法には、視覚的なデモンストレーションを通じて習得するのが最適なステップが多く含まれています。

組織の切片作成と包埋方法、および独学での習得が困難なAIハイブリダイゼーションプロトコルの重要なステップについて解説します。パラアルデヒド固定組織の包埋方法は、解析する組織の種類によって異なります。ここでの最も重要な点は、後の切片作成に向けてサンプルを正しく方向付けすることです。

埋込の一つの方法は、プラスチック製型とリングを使用することです。この手順を開始するには、まず60 °Cのウォーミングプレートで型を温め、そこに溶融パラフィンを注ぎます。次に、温めたピンセットを使用して組織試料を各型に移し、目的の方向に配向させます。

プレートから型を慎重にベンチへ移動させ、型の上の白いリングを配置します。さらに型とワックスを追加します。切片作成の前に、ワックスを徐々に冷却して硬化させます。

ブロックを室温まで温め、サンプルの周囲に約1mmのワックスを残して、各ブロックを台形にトリミングします。トリミングしたブロックを、2つの平行な面の長い方が下になるようにミクロトームにセットします。ブロックを慎重に刃先に近づけ、ブロックの表面が刃の断面と平行であることを確認します。

厚さを8〜10 µmにします。ワックスリボンをアルミホイルなどの非粘着性の表面に並べ、解剖顕微鏡下で目的の領域を選択します。次に、Prob Bon Plusスライドに鉛筆で印を付けます。

INI 2ハイブリダイゼーションプロトコルの過程で消去されるため、マーカーにペンを使用しないでください。各スライドに1 mLのクリーンなmilli Q水を分注します。室温で、目的の切片を水面に慎重に浮かべてください。

光沢のある面が水を向くようにしてください。スライドをゆっくりとスライドウォーマーに移します。温度を35〜37°Cに設定してください。

一般的に使用される 42 °C ではなくこの温度範囲を用いることで、切片の下に気泡が形成されるのを防ぎます。5分後、リボン状の組織がスライドグラス上にゆっくりと降りるように、注意しながら一度のスムーズな動作で水を注ぎ出します。組織切片を準備するため、組織が密着するように、スライドグラスを 37 °C で少なくとも数時間、または一晩乾燥させます。

in situ ハイブリダイゼーションを行うため、まず脱パラフィンおよび親水化処理を行い、脱パラフィン工程を完了させます。スライドを組織透明化剤で10分ずつ2回洗浄します。組織切片を親水化させるため、濃度の低いエタノール系列にスライドをそれぞれ30秒ずつ浸します。

本ビデオでは示していませんが、プロテアーゼ処理を行う際、0.1 molar triathlon amine溶液を入れたガラス皿を用意し、ドラフト内のスターラーの上に設置します。金属製スライドラックを溶液に入れる直前に、triathlon amine、緩衝液、および撹拌液に1.25 millilitersの無水酢酸を加えます。あわせて、スライドラックを固定するためのクランプシステムとスタンドを設置します。

Starrクランプの速度を下げ、スライドラックをスタンドに固定し、スターバーより高い位置を維持したままラックを溶液に浸します。PBSで洗浄し、再度エタノール系列で脱水した後、さらに10分間ゆっくりと攪拌し続けます。これで組織切片のハイブリダイゼーション準備が完了です。

スライドを清潔な表面に置き、5〜10分間完全に風乾させます。変性させたプローブを80 µLのハイブリダイゼーションバッファーに加えて、プローブハイブリダイゼーションバッファー混合液を調製します。各スライドについて、ピペッティングで十分に混ぜ合わせますが、気泡が入らないように注意してください。

プローブハイブリダイゼーションバッファーをピペットで分注します。スライドの右端で混ぜ合わせます。カバーガラスを徐々にスライドに載せ、ハイブリダイゼーション溶液が気泡なくすべての切片を覆うようにします。

気泡ができている部分のカバー snippet を指で軽く叩き、すべての組織切片から気泡を取り除きます。カバー snippet を剥がすと切片を損傷させるため、剥がさないでください。スライドを、UE water で湿らせた watman paper を敷き、その大部分を param で覆った湿度チャンバーに入れます。

ボックスをしっかりと密閉し、通常は50〜55 °Cで16〜20時間、目的のハイブリダイゼーション温度でスライドをインキュベートします。ハイブリダイゼーションプロトコルが完了したら、スライドからカバーガラスを慎重に取り除きます。スライドを垂直に立てるとカバーガラスが自然に脱落することがありますが、脱落しない場合は、切片を損傷させるためカバーガラスを無理に剥がさないでください。

代わりに、カバーガラスを取り外した後、温めた0.2倍SSCにスライドを1〜2分間浸してカバーガラスを洗い流し、スライドをラックに入れ、55 °Cの0.2倍SSCで数回洗浄します。RNase処理後、スライドをラックから平らなプラスチック製ボックスの底に移動させ、最小限の量のブロッキング溶液で覆います。緩やかに揺れるシェーカー上で、室温にて45分間スライドをブロッキングします。

次に、少量の抗体溶液を各スライドに直接滴下します。スライドを室温、暗所で2〜3時間インキュベートします。インキュベーション完了後、スライドを清潔なフラットボックスに移し、室温のシェイキングプラットフォーム上で、少量の洗浄バッファーを用いて4回洗浄します。

スライドをTBSで1回、TN緩衝液で2回すすぎ、調製したばかりの染色液を適用します。まず、染色液を小さなプラスチック製の秤量皿に注ぎます。次に、切片同士が向かい合うようにして2枚のスライドを重ね合わせます。

サンドイッチを溶液に浸し、毛細管現象によって溶液が吸い上げられるようにします。キムワイプの上でスライドの余分な液を切ります。スライドに染色液を満たします。

同様に、溶液が注入される際に気泡が生じるのを防ぐため、スライドを軽く叩く必要がある場合があります。スライドをプラスチック製のボックスに入れ、室温・暗所で保存してください。異なるプローブおよびarabidopsis組織を用いて得られた代表的な結果をここに示します。紫色のシグナルにより、標的遺伝子の発現パターンを細胞解像度で直接的に可視化できます。

パネルAは、栄養成長期の茎頂におけるshoot Meli one転写物の局在を示しています。メリステムの不定領域に紫青色のシグナルが存在し、周囲の葉にはシグナルが認められないことに注目してください。パネルB〜Dはシロイヌナズナの魚雷型胚の切片であり、Bは少数の胚茎細胞におけるcovata threeの発現を示しています。

Cは表皮層におけるT ML oneの発現を示しており、DはランダムなネガティブコントロールRNAでプローブ処理した切片におけるシグナルの欠如を示しています。続く画像は、トウモロコシ組織を用いて異なるプローブで得られた結果を示しています。パネルEは、発達中のトウモロコシ胚におけるSTM Humalog knotted oneの局在を示しています。

胚性茎および根の縦断面において、栄養シュート頂端に特異的に強いシグナルが認められることに注目してください。パネルFでは、ARF3Aが軸方向の下葉表面で発現しており、パネルGでは、ATML1ホモログであるOCL4が表皮に特異的に発現しています。予想通り、パネルHのネガティブコントロールプローブではハイブリダイゼーションシグナルは観察されませんでした。プローブのインビトロ転写における各チェックポイントの予想結果をここに示します。インビトロ転写後、DNA処理およびそれに続く転写反応液の精製後、標準的な agarose ゲルを用いてインサイチュハイブリダイゼーションプローブを確認します。プローブ1のような250 base pairs を超える長さのプローブにおいて、炭酸塩加水分解を行った後、使用可能な状態になると、炭酸塩加水分解によりさまざまなサイズのより短いプローブ断片が生成されます。

この図は、ドットブロット解析によるプローブのカラーおよび定量的評価の結果を示しています。100 ng/µLのコントロールプローブと、新たに標識した3種類のDIG標識プローブを10⁻¹から10⁻⁵まで希釈し、転写膜上にスポットして、抗DIG抗体およびアッセイでインキュベートしました。解析の結果、推定濃度はプローブ2が100 ng/µL、プローブ3が10 ng/µL、プローブ4が1 ng/µLであり、プローブ4では良好なin situハイブリダイゼーション信号が得られる可能性が低いことが示唆されました。最後に、Maceから得られた栄養シュート頂部の縦断面を用いて、非特異的なバックグラウンド信号と、良好に機能しているプローブパネルとの比較を行っています。

Aは非特異的なバックグラウンドシグナルを示していますが、パネルBは外細胞層におけるOC fiveプローブの特異的なin situ 2ハイブリダイゼーションシグナルを示しています。これをご覧いただくことで、お好みの遺伝子の正確な時空間的発現パターンを決定するために、in situハイブリダイゼーションプロトコルの多くの困難なステップをどのように実行すべきかについて、十分な理解を得られるはずです。