の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス

この手順の全体的な目的は、CLガンの軸索再生を研究するためのレーザーアブレーションシステムの組み立ておよびアライメント方法を示すことです。まず、レーザーグランド、Thompson偏光子、半波長板、回転ミラー、ペリスコープレール、およびレールミラーをブレッドボードに取り付けます。次の手順では、レーザービームを顕微鏡コンデンサーレンズからの出射ビームに合わせてアライメントします。

次に、レーザービームエクスパンダーレンズを取り付け、アライメントを行い、レーザービームを中央に配置して発散角をゼロにします。手順の最終ステップは、微調整を行ってレーザーアブレーションスポットを画像の焦点と一致させることです。最終的に、XY NCのアライメントが不完全な場合でも、回折限界レーザービームを用いることで、周囲の組織へのダメージを最小限に抑えながら、0.5 µmの軸索を精密に切断することが可能です。

フェムト秒レーザーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、15,000という比較的低コストであることです。また、比較的メンテナンスが不要であり、非常に精密な軸索切断が可能です。この方法は線虫の軸索再生に関する知見を得るだけでなく、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、末梢神経系、およびin vitroの細胞などの他の系にも適用可能です。

基本的には、表面から30〜50 µm以内にあるすべての細胞が対象となります。ブレッドボード上にコンポーネントを配置し、レーザーペリスコープポストと昇降レールサポートをボルトで固定することから始めてください。本システムでは、目に重大な損傷を与える可能性のあるクラス3Bレーザーを使用しているため、レーザー安全対策を徹底してください。

フリービームレーザーを安全に使用する方法について、所属先の物理学科の担当者に相談してください。アライメント作業中は、常にレーザーを最低出力に設定してください。接眼レンズから覗く際は、レーザーが機械的にシャッターで遮断され、電源がオフになっていることを確認してください。

次に、顕微鏡を配置します。まず、レール軸に合わせて位置決めを行います。次に、顕微鏡のコンデンサーレンズからの透過光ビームに合わせて調整します。最後に、レールに取り付けられた調節可能な絞りまたはレンズを使用して、レールの両端をコンデンサービームに合わせて調整します。

作業を続ける前に、水準器とラボジャッキを使用してレールの高さを調整してください。レールの両端が揃っていることを確認します。次に、レーザービームがグランド、Thompson偏光子、および1/2波長板を通過しており、回転時にそれらの端に当たっていないことを確認してください。

ハーフミラープレートを使用して、すべてのコンポーネントをブレッドボードに固定した状態でレーザー出力を調整します。レーザーの電源を入れ、パルス周波数を100の連続モードに設定し、ハーフミラープレートを用いて出力を最小限まで下げます。ポストイットまたはレンズペーパーを使用して、レーザービームを可視化してください。

次に、ブレッドボードからレーザービームを上昇させます。レーザーから順に、キネマティックマウントされたミラーを調整および固定し、ビームを昇降レールの端に取り付けられたミラーまで導きます。完了後、レーザービームが各ミラーの中央付近に概ね整列し、顕微鏡の透過光ビームとレーザービームを光軸合わせする前の段階で、各ミラーがレーザービーム軸に対して概ね45度に配置されている必要があります。

中間モジュールのNDフィルターおよび絞りをすべて取り外すか、開いてください。ここから、側副的な損傷を最小限に抑えつつ、軸索を精密に切断するための最も重要なステップに入ります。レーザー出力を最低に設定してアブレーションスポットを最小にし、x、y、z軸に合わせてレーザーを精密に調整します。

レーザー光と透過光を、紙を背景にして同時に確認することができます。まず、顕微鏡ポートの近くに紙を配置します。次に、ペリスコープ上部のミラーとレールの端にあるミラーの粗調整を行い、レーザーの光軸調整を開始します。

アライメント済みのコンデンサーレンズと開いた対物レンズ回転筒の間に紙を置きます。レールミラーの微調整を続け、レーザービームを透過光ビームの大きな中心に合わせます。その後、クランプで顕微鏡を固定します。

レーザーのアライメント評価に関する追加の手順は、本文の原稿で確認してください。10 mm対物レンズの背面開口部を充填するために、300 µmのレーザービームを33倍に拡大させるデュアル・ガリレオ式ビームエクスパンダーを設置する必要があります。まず、4枚のレンズをキャリアに取り付けることから始めてください。

次に、すべてのレンズが同一の光軸上にあり、かつレーザービームに対して完全に直交するように、レンズをレールに取り付けます。レーザーをオンにし、出力を最小に設定して連続モードにします。各レンズを通してビームの光軸を概略的に調整します。

紙を用いてビームを確認します。次に、レーザーの電源を切ります。レーザーにセーフティシャッターを取り付け、レーザービームの光路から顕微鏡を退避させます。

レーザーを再びオンにし、近くの壁で視認します。レンズの微調整を行い、ビームを拡大させます。次に、最後にある2枚のキネマティックマウントミラーを調整し、対物レンズの後方開口部の推定位置で、ビームが均一な明るさの円形になるように調整します。

紙を用いてビームのサイズと均一性を確認します。次に、紙をレンズから遠ざけた際のビームサイズの変化に注意しながら、ビームを調整して収束をゼロにします。レーザーの電源を切り、メカニカルシャッターを閉じます。

固定クランプを用いて正しいアライメントを定義し、顕微鏡をレーザービーム光路に戻します。顕微鏡のフリー側のクランプを取り付けますが、完全に締め付けないでください。これでレーザーを点灯させます。

セーフティシャッターを取り外し、対物レンズ回転筒をオープンポジションまで回転させます。ステージ上に紙を置き、拡大され均一化されたレーザービームがコンデンサーからの透過光軸に中心合わせされていることが確認できる状態にします。中心がずれている場合は、顕微鏡のクランプを緩め、顕微鏡を慎重に動かしてビームの中心を合わせます。その後、セーフティシャッターを閉じ、レーザーをトリガーモードに設定してください。

60倍の対物レンズをその場で回転させます。次に、ターゲットスライド上の表面の傷を撮影します。セーフティーシャッターを取り除き、アブレーションレーザーを作動させ、アブレーションスポットが最小になるようにレーザー出力を調整します。

スポットは円形で、画像中心から5〜10 µm以内に位置している必要があります。これがアブレーションスポットとなります。キネマティックマウント付きレールミラーの微調整を用いて、スポットを中心位置に維持し、ビームプロファイルを均一にするために、レールマウントミラーと上部ペリスコープミラーを繰り返し調整する必要があります。フォーカスを1 µmステップで系統的に上下に移動させ、各ステップでアブレーションレーザーを作動させることで、レーザーのZフォーカスを評価してください。

ビームが正しく拡張・整列され、収束が適切に調整されていれば、画像上の焦点でアブレーションが最大となり、焦点の 1 µm 上方または下方ではアブレーションが弱くなるか、あるいは全く起こらないはずです。最大アブレーションスポットが画像焦点の上方または下方に位置する場合は、ガリレオ望遠鏡のレンズ L3 を移動させて拡張ビームの Z 焦点の最終調整を行い、レーザーアブレーションを画像焦点と一致させます。線虫をカスタマイズしたスライドに固定し、構築したシステムを用いて軸索をアブレーションしたところ、レーザー外切除（Laser exosomy）および軸索再生のタイムラプスイメージングは非常に堅牢に実施できました。

電動ステージを用いることで、5匹の異なる個体から得られた5本の軸索を、1枚のスライド上でルーチンかつ精密に切断および撮像することが可能であった。軸索の撮像時間が制限要因となった。

約10%の実験で高品質なタイムラプス動画が得られました。残りの実験でもすべて良好なデータが得られましたが、固定から5〜8時間後に一般的に発生するワームのわずかなジッタリング（小刻みな動き）のため、視覚的な訴求力は劣っていました。本手順を試みる際は、x軸、y軸、z軸におけるレーザーのアライメントを正確に評価することが常に重要です。

軸索を切断しようとする際に最も頻繁に起こる問題は、側副的な損傷や軸索を完全に切断できないことであり、これはほぼ常にレーザーの光軸がずれていることが原因です。このレーザーアブレーションシステムとc Againsにおける軸索再生の可視化手法を用いることで、あらゆる遺伝子変異が軸索再生に及ぼす影響を日常的に評価することが可能になります。NCL Agains。