幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

本プロトコルでは、キトサンマイクロスフィアからコラーゲンゲルスキャフォールドへの幹細胞の導入、回収、および培養を行うためのin vitro戦略について解説します。まず、初代脂肪細胞幹細胞を乳化させ、キトサンマイクロスフィアの調製物を回収します。次に、幹細胞をキトサンマイクロスフィアに播種し、孔径8 µmのメンブレン培養プレートインサートで培養して、CS担持CSMを作製します。最後に、このマイクロスフィアデリバリーシステムを3次元コラーゲンゲルスキャフォールドと混合します。

最終的に、このCSMシステムは再生医療およびドラッグデリバリーへの応用の可能性を秘めています。細胞注入やマイクロカプセル化などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、細胞がキャリア材料に付着し、初期適用後も持続的に存在できる点にあります。一般的に、この方法に不慣れな方は、esanマイクロスフィアが本来的に静電荷を帯びているため、操作に苦労することがあります。

また、マイクロスフィア層の上に細胞を播種する際、細胞を乱さずに配置することは困難です。会陰部および表皮の脂肪組織を切り出し、洗浄して細切します。次に、1～2 gの組織を1% FBS含有HBSS 25 mLに移します。遠心分離後、遊離して浮遊している脂肪組織層を125 mLのエルレンマイヤーフラスコに回収します。

25 millilitersのコラゲナーゼ type twoを加え、オービタルシェーカーで反応液をインキュベートします。次に、オイル層および脂肪層の下にある液分を注意深く取り除き、170 micronsのナイロンメッシュフィルターで順次ろ過します。25 millilitersで2回洗浄した後、遠心分離によって細胞を回収します。

HBSSでの再懸濁後、ペレットを30 millilitersのサプリメント添加mesen pro成長培地に懸濁させます。精製した脂肪由来幹細胞を2本のT 75培養フラスコに分注し、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの加湿インキュベーター内でASC調製物を増殖させます。このCSMプロトコルは、イオン的コア技術を利用した水中油エマルションプロセスです。

6 mLのキトサン水溶液を100 mLの油相混合物に加え、オーバーヘッドスターラーとマグネチックスターラーを用いて1時間、互いに逆方向に同時に攪拌して乳化させ、安定した水中油型エマルションを作成する。その後、4時間にわたり15分ごとに1%水酸化カリウム n-オクタノール溶液を1.5 mLずつ添加する。イオン架橋反応の完了後、油相をゆっくりとデカンテーションで除き、速やかに球体を100 mLのアセトンに加える。油相が完全に除去されるまで、球体をアセトンで洗浄する。

その後、回収した球体を真空中で乾燥させます。粒度分析計を用いて、脱水処理を行い、CSM粒子サイズの平均、1 mgあたりの表面積、および単位立方体積を測定します。続いて、残留塩を除去するために、CSMを滅菌水で3回洗浄します。

次に、細胞実験に使用するため、CSM調製物を無水エタノールで滅菌します。50 mLのガラスチューブ内で、5 mgのマイクロスフィアを1 mLの0.5% TNBS溶液と混合し、40 °Cで4時間インキュベートします。その後、3 mLの6 N塩酸を加え、60 °Cで2時間インキュベートします。サンプルを室温まで冷却した後、5 mLの脱イオン水と10 mLのジエチルエーテルを加えます。

遊離TNBSを抽出するには、水相を5 mL分取し、ウォーターバスで40 °Cに15分間加熱して残留エーテルを蒸発させた後、室温まで冷却します。15 mLの水で希釈し、分光光度計を用いて測定します。TNBSをブランクとして、調製したキトサンマイクロスフィアの345 nmにおける吸光度を測定してください。

また、CSM調製に使用したキトサンの量を測定します。次に、キトサンの全アミノ基数に対するCSMの遊離アミノ基数を算出します。滅菌したCSM 5 mgを滅菌HBSS中で一晩平衡化させます。

CSMを24ウェル培養プレート用の8 µmメンブレンインサートに移します。CSMが沈殿した後、HBSSを慎重に吸引します。次に、インサートの内側に300 µLの増殖培地を、インサートの外側に700 µLの増殖培地を加えます。再懸濁します。

脂肪由来幹細胞を200 µLの増殖培地に懸濁し、培養プレート内のCSM上に播種します。インサートを37 °C、5% CO2加湿インキュベーター内で24時間インキュベートします。インサート膜内に遊走した細胞を乱さないように注意しながら、ASCをロードしたCSMを滅菌マイクロ遠心チューブに移します。

次に、残存している培地を除去し、各チューブに250 µLの新鮮な増殖培地を加えます。5 mg/mLのMTT溶液を25 µL加え、4時間インキュベートします。培地を除去し、250 µLのジメチルスルホキシドを加えてボルテックスし、フォルマザン複合体を可溶化させます。その後、CSMを2,700 ×gで5分間遠心分離します。

630 nmをリファレンスとして、570 nmにおける上清の吸光度を測定します。既知数の生存A SCから得られた吸光度値に基づき、CSMに関連する細胞数を決定します。A SCをロードしたCSM 5 mgを、ラット由来のタイプIコラーゲン 7.5 mg/mLと混合します。

尾腱のpHを2N水酸化ナトリウムを用いて6.8に調整し、培養プレートに注ぎます。繊維状にするために挿入し、その後12ウェルプレートに移して30分間インキュベートします。インキュベーション期間中は、1日おきにcollagen A-S-C-C-S-Mゲルの培地を更新し続けてください。

また、標準的な顕微鏡技術を用いて、CSMからゲルへの細胞の放出および遊走をモニタリングします。以下の例では、キトサンマイクロスフィアからコラーゲンゲルスキャフォールドへ脂肪由来幹細胞をデリバリーするためのin vitro戦略について説明します。SEMおよびTEM画像は、均一なサイズの多孔質CSMが調製されていることを示しています。

マイクロスフェアと脂肪由来間葉系幹細胞を共培養した結果、CSMカルシウムアミド1 mgあたり4,000個の細胞が認められました。SCの染色により、細胞がCSM上で伸展し、マイクロスフェアの多孔質な隙間にフィロポディアを伸ばしていることが示されました。細胞を播種したCSMをコラーゲンゲルと混合すると、細胞がゲル内へと遊走し、その経過を追跡することが可能です。

この手法の意義は、広範囲かつ慢性的な組織欠損の治療へと即座に展開されます。さらに、この治療レジメンは、軟組織や心組織のさまざまなレベルの欠損治療に用いられる多種多様な細胞やバイオマテリアルと統合できる汎用性を備えているため、より大きな可能性を秘めています。本手法がホスト細胞のデリバリーに関する知見を提供し得ることが期待されます。

また、注射剤などの他のシステムにも適用可能であり、治療薬の送達や、細胞と治療薬の両方を同時に送達するハイブリッドシステムの開発にも利用できます。