オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

こんにちは、カナダ農業・農産食品省のTim Dusoです。このビデオでは、Bio-Plex装置を用いて、複雑な臨床検体または環境試料中に存在する特定の微生物の有無および量を決定するためのプロトコルを実演します。このプロトコルでは、種特異的なオリゴヌクレオチドプローブが化学的に結合した蛍光ポリスチレンビーズを使用します。

ユニバーサルPCRプライマーを用いてサンプルからアンプリコンを生成し、そのアンプリコンをプローブ結合ビーズにハイブリダイズさせます。Bio-Plex装置により2つの信号が生成されます。1つはビーズを識別するための信号であり、もう1つはハイブリダイゼーション信号を定量するための信号です。

本手順の全体的な目的は、目的の微生物叢のプロファイルを迅速かつ半定量的に決定することです。我々はこの手法を膣 swabsにおける細菌プロファイルの決定に適用し、得られたデータを細菌性膣症の診断に利用しています。細菌性膣症とは、Lactobacillus属の菌が減少し、Gardnerella、vais、およびapoian vaeなどの他の微生物が膣 swabsで検出可能になるという、微生物叢の変化を特徴とする臨床状態です。ただし、この手法は迅速なマルチプレックスアッセイが望まれる他のあらゆる微生物叢にも適用可能である点に留意することが重要です。

まず、本手順の仕組みについて説明します。スワブから抽出したDNAに含まれるすべての生物から、タンパク質および遺伝子シャペロンコーティング遺伝子を増幅させることにより、微生物プロファイルを生成します。ユニバーサル増幅プライマーの1つには、ビオチンの添加およびリン酸化修飾塩基の導入という改変が加えられています。

5'末端において、T7 exonucleaseを用いてアンプリコンを単鎖にします。このヌクレアーゼはアンチセンス鎖のみを分解します。センス鎖はリン酸化修飾されたPCRプライマーによって保護されているため、残った鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを蛍光ポリスチレンビーズに共有結合させます。各ビーズの色ごとに異なる生物を検出するプローブが含まれているため、1つのサンプルに対して最大100種類の異なるビーズを使用することが可能です。

膣スワブから得られた単鎖PCR産物を、目的とするすべての微生物に対するプローブを含むプローブ結合ビーズ混合液でハイブリダイズさせます。次に、ストレプトアビジン複合体を介してビオチン化プローブに結合する蛍光レポーターであるフィコエリスリンを添加します。最後に、このハイブリダイゼーション混合液をLuminexまたはBio-Plex装置で解析し、各ビーズの個別の同定およびハイブリダイゼーションシグナルを検出します。

この分析結果は、特定の微生物の存在を示しており、ハイブリダイゼーションシグナルの強度はその微生物の存在量と相関しています。サンプルにおいて、BV関連微生物の存在はbvの診断に利用できます。グラム染色のような既存の手法に対するこの手法の主な利点は、特定の微生物の存在とその存在量に関する情報が得られることです。

当研究室のリサーチアシスタントであるJennifer Townが手順を実演します。マイクロスフィアを約20秒間ボルテックスして再懸濁させます。マイクロスフィアを400 µL取り出し、エッペンドルフチューブに入れ、14,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去して廃棄してください。その後、マイクロスフィアを50 µLの0.1 M MES (pH 4.5) で再懸濁させます。

キャプチャーオリゴを1 nmol分マイクロスフィアに加え、ボルテックスで混合します。新鮮なEDC溶液を2.5 µL、マイクロスフィアに加えます。反応液を室温、暗所にて30分間インキュベートします。

先に調製したEDC溶液を廃棄し、10 mg/mLのEDC水溶液を新たに調製します。上記と同様に、新鮮なEDC溶液をさらに2.5 µLマイクロスフィアに加え、5秒間ボルテックスします。再度、室温・暗所にて30分間インキュベートします。

1 mLの0.02% Tween 20を加え、ボルテックスでビーズを再懸濁させて洗浄し、14,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、廃棄してください。さらに1 mLの0.1% SDSを加えてビーズを再度洗浄します。最後に、100 µLのTEバッファーでビーズを懸濁させます。

ヘモサイトメーターを用いてビーズを計数し、ストック濃度を決定します。各ビーズをTEバッファーで希釈し、最終濃度が1 µLあたり100ビーズとなるようにマイクロスフィアマスターミックスを調製します。アッセイの目的のプレックス数に応じて、カップリング済みビーズを混合します。マイクロスフィアマスターミックスは、4°Cの遮光条件下で保存してください。これらの条件で保存すれば、この混合液を数ヶ月間保存することが可能です。その後、各サンプルのPCR産物を生成します。

PCR完了直後に、ホスホレートおよびビオチン修飾5'プライマーセットを添加します。各PCRチューブに T7 exonuclease を 2 µL 加え、室温で40分間インキュベートします。このインキュベーションの終了後、0.5 M EDTA (pH 8.0) を 12.5 µL 混合液に加えます。

これにより、合計約 64.5 µL の単鎖 PCR 産物が得られます。ピペットを用いて Resus Bend Microsphere マスターミックスを再懸濁させます。適切な量をエッペンドルフチューブに分注してください。

チューブにキャップをし、ウォーターバスソニケーターで2分間超音波処理します。低プロファイル96ウェルプレートの適切なウェルに、17 µLの単鎖PCR産物を分注し、それぞれに33 µLの再懸濁済み超音波処理ビーズ混合液を加えます。

プレートにシリコンカバーを被せてタッピングします。プレートをサーマルサイクラーに慎重にセットし、95 °Cで5分間、60 °Cで10分間、その後60 °Cで保持（または60 °Cで5分間の一時停止）というプログラムを設定します。終了し、プログラムを開始します。

新鮮なstrep Aden FICO Ethin溶液を調製します。1ウェルあたり25 µL必要です。ストック溶液を1 mg/mLに希釈して、strepおよびFICO ethinを調製してください。

1x TMACバッファーを用いて、50～20 µg/mLに調整します。サーマルサイクラーが60 °Cの保持ステップに達したら、蓋を開け、シリコンカバーを取り外して、Strep-din-FICO-ethin溶液を各ウェルに直接添加します。シリコンカバーを戻してサーマルサイクラーの蓋を閉め、プログラムを再開します。

プログラムが完了したら、プレートを取り出し、速やかにBio-Plexマシンに移して読み取ります。プレートは10分以内に読み取る必要があります。プレートは60°Cで読み取ってください。

Bio-Plexがこの温度まで予熱されていることを確認してください。ここでは、単一の個体から採取されたタイムゼロにおける縦断的サンプルの、対応するグラム染色結果とLuminexプロファイルを示しています。グラム染色はBVの臨床診断と一致しており、これはGardnerella vaginalisおよびAtopobium vaginaeを含むBV関連微生物に対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示すFiveplex Luminexアッセイによって裏付けられています。

時間の経過とともに、Lactobacillus Inersも低レベルで検出されます。グラム染色で示されるように、この個体はBV微生物叢から正常な微生物叢へと移行しています。これらの同一サンプルをLuminexで解析したところ、Gardnerella Vaginalisの存在量はピークに達した後に減少し、一方でlactobacillus inersが増加して、最終的なタイムポイントまでに優位な微生物となったことが示されました。

この方法を用いて微生物相のプロファイリングを行うことで、特定の微生物の存在およびその存在量に関する情報を得ることができます。本手法はシーケンスベースであるため、プローブ設計にディープシーケンシング解析の結果を反映させることができ、次世代シーケンシング法で特定された微生物を、迅速かつ比較的低コストな方法で試料中から追跡することが可能です。このビデオを視聴することで、LuminexまたはBio Plex装置を用いて試料から微生物プロファイルを作成する方法について、十分な理解が得られたことと思います。

オリゴヌクレオチドプローブを蛍光ビーズに結合させ、臨床サンプルまたは環境サンプルから一本鎖DNAを生成し、ハイブリダイゼーションを行い、LuminexまたはBio Plex装置で結果を判定する方法について説明しました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。