層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

このビデオ記事の目的は、接着細胞を層流条件下にさらし、定量可能な流体せん断応力に対する反応を評価する手法を解説することです。まず、フローチャンバーを除いた状態で流路回路を組み立てます。回路には、リザーバー、パルスダンパー、ハードチューブ、ソフトチューブ、4方活栓および接続用ルアーアダプター、ならびにエアフィルターが含まれます。

次のステップは、無菌条件下で細胞培地などの目的の緩衝液を回路に満たし、ポンプを始動してパルスダンパーを満たし、チューブ内の空気を除去することです。続いて、細胞が載ったスライドをフローチャンバーの底板に挿入します。手順の最終ステップは、フローチャンバーを直列に組み込み、フロー回路を完全に組み立てることです。

最終的に、蛍光顕微鏡を用いて透明チャンバー越しに流体せん断応露にさらされた蛍光標識血管内皮前駆細胞の配列を確認し、細胞の機能的な挙動を研究することが可能です。細胞の機能的挙動を研究するためには、流体せん断応力を加えることで生体内の生理学的条件を模倣することがしばしば必要となります。本研究では、フロー条件下で細胞を研究し、透明チャンバーを通して観察できる平行平板フローチャンバーおよび連続フロー回路を設計しました。

この手法は、医学および工学の分野において有用な研究ツールとなります。当社のフローチャンバーを使用することで、正立顕微鏡または倒立顕微鏡を用いて、流れの中にある細胞の間欠的またはリアルタイムな可視化が可能です。さらに、Dr.Ach Nickの設計により、研究者は標準的な顕微鏡レンズを使用して、透明な表面または放射線不透過性の表面上の細胞をイメージングすることができます。

さらに、流れ条件下での細胞に対する薬物の影響を研究するための、薬理学研究における重要なツールとして活用できます。いくつかの手順はプロトコルを読むだけでは習得が困難であるため、セットアップの視覚化が不可欠です。ここでは、Dr.Ock Nextの研究室で一般的に使用されているフローチャンバーとフロー回路のセットアップ方法について、ステップバイステップで説明します。フロー回路を組み立てます。

まず、36 inchのハードチューブのセグメントをパルスダンパーの一端に取り付け、もう一端を接続します。次に、18 inchのソフトチューブのセグメントを取り付けます。18 inchのソフトチューブセクションの末端に、1/8 inchのオスルアーアダプターを装着します。

オス側のルアーを1/8インチのメス側ルアーアダプターに接続します。メス側のルアーを、新しく切り出した18インチのソフトチューブのセグメントに取り付けます。250 milliliterのガラスビーカーのキャップに3つの穴を開けます。

チューブを適合させるため、1.5 inchのソフトチューブのセグメントを1つの穴に挿入し、エアベントとして使用します。ハードチューブとソフトチューブの自由端を、キャップの残りの2つの穴を通して、リザーバーとして機能する250 milliliterのガラスボトルに挿入します。

ハードチューブがリザーバーの底部まで届いていることを確認してください。回路のセットアップ全般において無菌状態を維持することが、本手順を成功させるために不可欠です。したがって、すべての部品を滅菌し、全過程を通じて滅菌手袋を着用してください。

組み立て済みの部品に加えて、以下の部品を滅菌する必要があります。フローチャンバー1個、3×2インチのソフトチューブセグメント（オスとメス各1本）、1/8インチのルアーアダプター、1/2インチの皿ネジ4本、6 5/16インチのネジ（1インチあたり30山）8本、ピンセット1ペア、ガラススライド1枚、およびタオル2枚を蒸気滅菌してください。

121°Cで60分間オートクレーブ滅菌します。フロー回路、フローチャンバー、4方活栓4個、1方活栓1個、およびすべての滅菌済み部品をこの滅菌野の上に配置します。滅菌手袋を着用し、2つの4方活栓を接続します。

開いたサンプルポートにキャップをはめます。フロー回路の2つのソフトチューブセグメントを接続しているオスおよびメスのルアーアダプターを取り外し、接続されたストップコックを挿入します。リザーバーに挿入されているソフトチューブを30 milliliterシリンジに取り付け、シリンジのプランジャーを取り出します。

ボトルに125 millilitersのEPC培地を満たします。ソフトチューブをストップコックに再接続します。エアベントに滅菌済みのシリンジフィルターを装着します。

次に、フロー回路を37°C、5% 二酸化炭素の加湿インキュベーターに移します。このタイプのCoal Palmerチューブに使用するように指定されているマスターフレックス・ローラーポンプヘッドに、ハードチューブを固定します。チューブがローラーポンプの取り付けトラックに重ならないようにしてください。

ポンプヘッドの両側でチューブが出ている箇所に、マーキングペンで印を付けます。すべてのストップコックがサンプルポート側で閉じられ、流路に沿って開いていることを確認した後、ポンプを始動させます。流れの方向を確認してください。

PERFUSE 8は、ガラスリザーバーからハードチューブを通ってパルスダンパーに移動させる必要があります。フローチャンバーの組み立てには、滅菌手袋を着用し、2インチのソフトチューブセグメントを1/8インチのメス用ルアーアダプターに接続します。さらに別の2インチのソフトチューブセグメントを1/8インチのオス用ルアーアダプターに接続します。

メス用ルアーアダプター付きの2インチソフトチューブを流入ポートに、オス用ルアーアダプター付きの2インチソフトチューブを流出ポートに取り付けます。これらのルアーアダプターの両方に4方活栓を取り付けます。残りの2インチソフトチューブをバブルトラップから出ているサイドポートコネクターに接続し、滅菌ピンセットを使用して一方向活栓を取り付けます。

細胞を播種したスライドを細胞培養容器から取り出し、フローチャンバー底板の凹部に設置します。スライドの細胞播種面が上を向いていることを確認し、シリンジまたはピペットを用いて、温めたEPC培地10 millilitersを細胞播種スライドの上に注入します。培地がフローチャンバー内でスライドを覆うようにしますが、底板のOリングの上に培地がこぼれないように注意してください。

フローチャンバーの上プレートを下プレートの上に置き、ネジ穴の位置を合わせます。チャンバーのネジプレート内に気泡が入らないよう、2枚のプレートを平行に保ってください。自動バッテリー式ドライバーを使用して、流入側のバブルトラップポートに取り付けられたワンウェイストップコックを開き、流入バブルトラップ内の空気を抜きます。

10 mLシリンジを用いて、流入チューブをEPC培地で緩やかに洗浄し、その後、このストップコックを閉じてキャップします。次に、流出ポートの4方活栓を開き、フローチャンバーにEPC培地を緩やかに流して、チャンバーチャネル内の気泡を除去します。再び10 mLシリンジを用い、4方活栓のすべての接続箇所にキャップをして閉じます。

組み立てたフロー回路とともに、フローチャンバーを加湿インキュベーターに移します。フロー回路ポンプを一時停止させ、漏れを防ぐために流れ方向に沿ってフロー回路のストップコックを閉じてください。

フローチャンバーをフロー回路に接続します。フローチャンバーの接続後、流路方向に沿ってストップコックを開きます。フローポンプを再稼働させ、PERFUSE eightが正しい方向に流れていることを確認してください。流速を調整し、目的のせん断応力に設定します。

フロー実験中に、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で細胞を観察するために、フローチャンバーを回路から取り出すことができます。そのためには、ストップコック同士の接続部分で、フローチャンバーをフロー回路から切り離してください。分析用に灌流液のサンプルを採取します。

まず、ポンプを停止させ、パルスダンパーに最も近いストップコックを閉じます。保護キャップを取り外し、汚染を防ぐため、キャップを逆さまにして置きます。サンプルポートに小型シリンジを挿入します。

ストップコックをフローチャンバー側で閉じ、サンプルポートおよびパルスダンパー側の回路を開いたままにします。回路から必要な量のサンプルを吸引し、シリンジを取り外す前にサンプルポート側のストップコックを閉じます。採取したサンプルをラベル付きのバイアルに保存し、-80 °Cで凍結させます。

サンプリングポートを密閉し、フローを開始する前にすべてのストップコックが開いていることを確認します。この方法を用いることで、ヒト血液由来の内皮前駆細胞を15分以内にチタン製スライド上に播種し、生理的な剪断力の下で接着させることができます。この図に示すように、EPCは、15 dynes/cm²の流体剪断応力下において、播種直後の約210 µm²から、3時間後には約657 µm²、48時間後には約1,152 µm²まで、フローの影響を受けて拡大します。

この光学顕微鏡画像は、ヒトEPCのランダムな配向を示しています。100 dines per square centimeterの流れを3時間加えた後、6時間の静止期間を置いた状態では、細胞は伸展していますが、配向はランダムなままです。100 dines per square centimeterの流体せん断応力を48時間加えると、EPCは流れの方向に沿って整列し、配向します。

ここでは、EPCsをCTOで標識し、フロー後の細胞核をherxで染色しました。比較として、この画像はチタン製スライド上の豚EPCsをフロー方向に沿って配列させた状態で示しています。48時間のフローおよび15 dynes/cm²のせん断応力曝露後、細胞境界をanti pcam染色で、核をcytoxin核酸染色で染色しました。

この手法を用いることで、分泌された細胞代謝物の分析および定量のために、あらかじめ設定した時点でPERFUSE 8からサンプルを回収することも可能です。ここでは、ブタEPCを用いた48時間のフロー実験における亜硝酸塩の生成例を示します。この手順を実施する際は、終始無菌状態を維持することが重要です。

さらに、連続流を開始する前に、フローチャンバー内の気泡を減らすために必要な措置を講じることが重要です。気泡は細胞を剥離させる可能性があるためです。また、実験中のPERFUSE eightの漏出を防ぐため、灌流前にフローチャンバーおよび回路のすべての接続箇所を確認することを推奨します。このチャンバーは、上部プレートと下部プレートを完全に密着させることができ、真空ポンプを必要とせずに漏れのないシールを実現するOリングを内蔵した設計となっています。

この機能により、実験間でチャンバーの高さを一定に保つことができ、ゴム製ガスケットや調整の必要性がなくなります。当社のフローチャンバーでは標準的な顕微鏡スライドを使用するため、後続の実験に利用できる大量の細胞を確保することが可能です。

例えば、フロー後の細胞から抽出したRNAおよびDNAを用いて、タンパク質合成や遺伝子発現を評価できます。当社の回路設計では、灌流した8つのサンプルを回収して分析することが可能であり、流体剪断応力下で細胞から分泌される一酸化窒素の主要な酸化代謝物である亜硝酸塩などの細胞代謝物を定量できます。このビデオを視聴することで、接着細胞に流体剪断応力を負荷するためのフローチャンバーおよび滅菌フロー回路の組み立て方法について、十分に理解できるはずです。