誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

本手順の全体的な目的は、プリント回路基板（PCB）を用いた誘電泳動（DEP）により、マイクロ流体デバイス内の細胞およびビーズを操作することです。まず、PCB電極とマイクロ流体チャネルを設計し、作製します。次に、PCBマイクロ流体アセンブリ、ならびにビーズおよび細胞の溶液を調製します。

手順の第3ステップは、チャネルに低電導度培地を満たし、次にビーズと細胞をロードすることです。手順の最終ステップは、PCBアセンブリをパワーアンプおよびファンクションジェネレータに接続し、DEPを開始することです。最終的に、DEPを用いることで、マイクロ流体デバイス内での細胞とビーズの分離および操作を示す結果を得ることができます。

一般的に、この手法を初めて導入する方は、目的の細胞やビーズの操作に適したマイクロ流体デバイス向けの効果的な電極を開発するために、DEPの原理を理解する必要があるため、困難に直面することがあります。一方で、PCBを電極として使用することで、マイクロ流体デバイスにおける細胞やビーズの駆動を、幅広い科学分野で取り組みやすいものにできます。本手順の最初のステップは、不均一電界を発生させるために、所望の形状を持つプリント基板（PCB）電極を設計することです。

設計が完了したら、商用の製造施設を通じてカスタマイズされたPCB電極チップを注文します。特注のPCBが届いたら、開封して本デモンストレーションのための点検を行います。PCBのサイズは、長さ8.4 centimeters、幅2.1 centimetersです。

金属電極の幅は5 mmです。この例では、電極は2本の長い金属ストリップと、電極が櫛形に組み合わされた（インターディジテートされた）長さ4.5 mmのクロス領域2箇所で構成されています。これらのインターディジテート領域は、強力な不均一電界を発生させ、刺激装置からPCB電極への接続を形成します。

16ゲージのワイヤーを電極の端に配置します。加熱した半田ごてを使用して、PCBの金属部分にワイヤーを固定します。これにより、ワイヤーが加熱されます。

はんだを加熱されたワイヤに当て、少量のはんだをワイヤに流し込みます。ワイヤにはんだが充填されたら、はんだが冷えるまでワイヤを固定したまま、はんだごてを離します。PCB上のもう一方の電気接続部についても、同様にはんだ付けの手順を繰り返します。

次のステップは、目的の分岐パターンを持つマイクロ流路を作製することです。標準的な微細加工技術を用い、シリコンウェハーとSU-8フォトレジストを使用して、流路を定義するためのマスターモールドを作製します。このマスターモールドは、1つの入口流路と3つのターゲット流路で構成されています。

チャネルの幅は100 micrometers、高さは27 micrometersです。マスターモールドを作成後、ポリメチルシリロキサン（PDMS）エラストマーと硬化剤を重量比10:1で混合し、5分間待ちます。液状のPDMSをあらかじめ作製したSU-8マスターモールドに流し込み、液状PDMSを3分間真空状態にさらして気泡を除去します。

必要に応じて真空脱気工程を繰り返し、すべての気泡を完全に除去します。必要であれば、窒素ガスを吹き付けることで余分な気泡を除去することも可能です。PDMSを70 °Cのオーブンで2時間硬化させます。

カミソリの刃を使用して、マイクロ流路を備えたP-D-M-S-Sラボをウェハーから取り除きます。流路部分を上にした状態で、ウェハーを破損させないよう注意してください。バイオプシーパンチを使用して、マイクロ流体デバイスに液体と細胞を導入するための穴を開けます。端を整えます。

余分なPDMSを取り除きます。マイクロ流体デバイスを確認し、ほこりやゴミが付着していないことを確かめてください。3Mスコッチマジックテープを使用してPDMSを清掃します。

PDMSチャネルと、洗浄済みの厚さ80～130 µmのNo.0カバーガラスをプラズマガスに1.5分間曝露させます。プラズマクリーナーからPDMSスラブとカバーガラスをペトリ皿に取り出し、PDMSマイクロ流路チャネルをカバーガラスの上に合わせ、プラズマ接合させます。このカバーガラスとマイクロ流路の組み立て体を、100 °Cに設定したホットプレート上で最低15分間加熱します。マイクロ流体デバイス作製の最終ステップは、PDMSチャネルとカバーガラスをPCBの電極の上に配置することです。

まず、PCB上にミネラルオイルを約10 µL滴下します。PCBとカバーガラスを密着させるため、カバーガラス付きのマイクロ流体チャネルアセンブリをオイルを塗布したPCBの上に配置します。オイルに接触させながらカバーガラスマイクロ流体アセンブリを軽く押し下げ、密着性を高めて、細胞やビーズの可視化を妨げる気泡の混入を最小限に抑えます。

もう一つの重要なステップは、脱イオン水を用いて、重量対容量比で8.5%スクロースおよび0.3%グルコースを含む低導電率培地ミックスを調製することです。これでマイクロ流体デバイスの使用準備が整いました。ピペットを用いて、必要に応じて各マイクロ流体チャネルに15から20 µLの低導電率培地を満たします。真空吸引を用いて、チャネル内の気泡を除去してください。

次のステップは、テスト粒子をマイクロ流体デバイスに導入することです。本デモンストレーションでは、低導電性媒体に1µLあたり550個のポリスチレンビーズを分散させた懸濁液を使用します。ビーズは時間の経過とともに沈殿する場合があるため、攪拌して再懸濁させてください。次に、ピペットを使用して、ポリスチレンビーズ懸濁液200µLをチャネルに導入します。

次のステップでは、電極を準備し、ファンクションジェネレーターの出力をAC電源アンプの入力に接続します。次に、アンプの出力を電極線に接続します。ユーザーが感電するリスクを防ぐため、すべての電線と装置の表面を絶縁テープで覆います。

ファンクションジェネレーターを、1から1.5 MHzの正弦波を出力するように設定します。このセットアップで細胞とビーズの分級を開始するため、DEPを起動します。右側に入口チャネルがあり、3つのターゲットチャネルが三叉分岐点で分かれています。

PCB電極は、層流がなくDEPもかかっていない状態の黒いストライプに対応しています。DEPを開始すると、流れがない状態ではビーズはほぼ静止しています。層流が流れているときは、ビーズはPCB電極に向かって移動し、電極間の空間から遠ざかります。

DEPがオフの状態では、流入チャネルを流れるビーズは3つのターゲットチャネルに分散されます。DEPが開始され、層流が形成されると、ビーズは中央チャネルのみを流れるように駆動されます。以降のビデオでは、マイクロ流体デバイスをPCB電極の上で回転させ、チャネルの向きを変更しています。

PCB電極に関して。以前はPCB電極に対して垂直であった入口チャネルは、層流状態ではほぼ電極と平行になります。しかし、DEPがオフの状態では、ビーズは3つのターゲットチャネルすべてに均等に入ります。

DEPを開始すると、ビーズが三叉分岐点に近づき、DEP力によってビーズが電極上のサイドチャネルへと引き込まれます。ビデオの次の図では、ヒト結腸腺がん細胞（HT 29細胞）と蛍光ビーズの混合物がマイクロ流体デバイス内にある様子を示しています。このDIC画像において、開いた矢印は層流の方向を示しており、チャネルは破線で囲まれています。

反射金属電極は明るい背景のストライプとして確認できます。ビーズのイメージングにはDIC顕微鏡が使用されており、輝度スケールを調整することで細胞をより可視化しています。

この図は別の図と同じ画像ですが、グロースケールの強度画像として表示されており、ビーズだけでなく細胞も可視化されています。この図では、反射性の金属電極が黄色と緑色の縞模様として現れています。DEP（誘電泳動）を用いると、DIC画像に示されているようにビーズは右側のチャネルから流出しますが、HT 29細胞は、DEP開始前のグロースケール画像に示されているように、中央および左側のチャネルから流出します。細胞とビーズの混合溶液が、1つの入口チャネルから3つの独立したターゲットチャネルへと流れています。

DEPを誘導した後、ビーズと細胞を選択的に異なるチャネルへと駆動させます。このビデオを視聴することで、マイクロ流体デバイス内での細胞およびビーズの操作に向けたダイアル電気泳動の実装方法について、十分に理解できるはずです。