の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）キューティクルの構造

本手順の全体的な目的は、赤色蛍光親油性染料であるdye eyeを用いて、透明な生きたC. elegansのクチクラを可視化することです。まず、染色のための線虫集団を調製します。次に、希釈したdye eyeをこの集団に加え、インキュベートします。

その後、動物を染色液から回収します。Daiで染色したクチクラの蛍光イメージングでは、AileyおよびAnn eyeの生殖構造やその他の外部形態学的特徴を含む表面の詳細が示されます。直接イメージング、蛍光、トランスジェーン発現、抗体染色、電子顕微鏡、および標識小麦胚芽凝集素などの、この透明な生物のクチクラを可視化するための既存の手法に対する本手法の主な利点は、比較的迅速かつ安価に簡単に実施でき、生体動物におけるクチクラ構造の高い解像度を得られることです。

この手法は、細胞分泌やクチクラの構成、表皮細胞の発達、ヘテロクロニック遺伝子経路、自然免疫、形態的形質の形成、および線虫の進化など、C. elegansモデルシステムとそのクチクラを利用する多くの分野における重要な疑問の解決に役立ちます。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるRobbie Schultzが行います。DiIを取り扱う際は、光感受性であることに注意してください。

D eyeは常にホイルで包み、遮光してください。また、DMFは毒性があり、DAIは発がん性物質であるため、手袋と白衣を着用してください。シアン化Daiは非常に強力です。

標準強度の作動希釈液は、M9緩衝液に30 µg/mLのDIIを溶解させたものであり、単一の個体群につき400 µLの作動希釈液のみが必要です。まず、汚染のない線虫が飼育されている60 mmプレートを用意します。プレートから動物を回収し、1.5 mLの0.5% Triton X 100で洗浄します。

M9バッファー中で、液体を円を描くようにゆっくりと揺らして、すべての幼虫および成虫を剥離させ、洗浄液を1.5 mLチューブに移します。直ちに2000 rpmで30秒間遠心分離し、チューブの底に個体を回収します。個体を乱さないように、上清を可能な限り除去します。

欲張らずに慎重に行ってください。動物を1 mLのM nineで洗浄します。遠心分離し、上清を除去します。

洗浄を繰り返します。再度遠心分離し、上清を除去します。次に、M9培地で調製した30 µg/mLのDai 400 µLをチューブに加えます。

チューブを短時間ボルテックスし、動物を再懸濁させます。次に、遮光条件下でチューブを水平に置き、20 °C、350 RPMで3時間から16時間振盪します。これら直前のステップのタイミングは重要です。

まず、daiが結合する脂質が除去されないよう、Triton Xを洗い流す必要があります。次に、キューティクルが均一に染色されるまで、動物をdye eye溶液で十分に染色します。その後、結合していないeyeを除去するため、動物を餌の上で十分に回復させます。

染色の終了後、動物を遠心分離して沈殿させ、染料溶液を除去します。1 mLのM9バッファーで動物を洗浄します。結合していない染料を除去するため、動物を遠心分離して上清を除去します。

動物を400 µLのM9バッファーで再懸濁し、OP50 E. coliを播種したNGMマイクロプレートの細菌がいない部分に注ぎます。暗所で少なくとも30分間、ただし最長でも1日で動物を回復させます。回復時間中に染料の蛍光が減衰するためです。動物は染料の染色液から離れ、餌の方へ移動します。

これらの動物は、遊離染料による眼の背景蛍光が少ないため、イメージングがより容易です。まず、スライド上にアガロースパッドを準備します。使用するアガロースパッドの厚さを均一にするために、2つのスペーサーを使用してください。

2枚のラボテープをガラススライドに重ねてスペーサーを作成します。スペーサーは繰り返し使用することが可能です。次に、2枚のスペーサー付きスライドの間にきれいなガラススライドを縦方向に配置し、溶融した4%アガロースを約150 µLピペットで分注します。

清潔なガラススライドの中央に滴下します。溶融したAERの上に、別のスライドを垂直に配置して素早く覆い、2つのスペーサーとともにアガーパッドを形成します。カバースライドを慎重に滑らせて外し、パッドがマウンティングスライドの上部の中央に位置するように保持します。

次に、線虫麻酔剤5 µLをパッド上にピペッティングし、8〜12匹の個体を麻酔剤の中に載せ、マイクロスコープカバーガラスで静かに覆います。40倍以上の対物レンズとTRITCフィルターまたはその他の互換フィルターを備えた、複合顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて個体を観察します。Dye Iの蛍光励起極大は549 nm、蛍光放出極大は565 nmです。

結合ダイのイメージングは、本プロトコルにおいて最も困難な工程です。ここでは動物のイメージング用マウント方法を示しますが、使用する共焦点顕微鏡や複合顕微鏡については、適切にトレーニングを受けておく必要があります。染色法によって照らされた詳細な構造を分解するには、少なくとも60倍以上の倍率を持つ対物レンズを使用するのが最適であることがわかりました。

このセクションの画像はすべて、胚後期のC. elegansを63x対物レンズを用いて撮影したものです。クチクラ表面は、環状の溝によって年次的に区切られており、一部のステージではアイルと呼ばれる縦方向の隆起が見られます。このセクションの画像はすべて、胚後期のC. elegansを63x対物レンズを用いて撮影したものです。

キューティクルの表面には、周方向の溝によって分けられた環状の領域と、一部のステージではaleyと呼ばれる縦方向の隆起が存在します。各発生段階のキューティクル構造は、表面組成に応じて、aleyおよびAlyの隆起や溝がそれぞれ異なる組成とパターンを持っており、蛍光染色することが可能です。

この染色定置法を用いれば、幼虫および成虫のすべての段階において、回収後最大1日間は可視状態が維持されます。背景に蛍光の斑点が観察されることがありますが、日常的に起こることはありません。これは、中程度のクチクラ組織欠損を示す成虫変異体のクチクラです。

Ailey ridge（アイリーリッジ）は不連続で過剰に存在します。Ailey ridgeは融合し、分枝または二分しており、一般的なトランスジェニックマーカーとなります。dominant roll six対立遺伝子はクチクラのねじれを引き起こし、これがaileyに観察され、環状構造（annuli）を不規則なパターンにさせることがあります。

Daiは、成体雌雄同体、陰門、および成体雄の尾部挙上部やファンを含む、その他の外部クチクラ構造も染色します。また、このように二股に分かれた尾のような、外部形態のわずかな欠陥を強調することも可能です。例えば、2時間の染色ではクチクラの染色にムラが生じますが、環境に露出しているニューロンは染色される場合があります。適切に実施すれば、この手法は習得後、イメージング時間を除いて4時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、クチクラやその他の外部形態構造を観察するために、Daiを用いてC. elegansを染色する方法を十分に理解できるはずです。