フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

本実験の全体的な目的は、フローサイトメトリーを用いて新生マウスの蝸牛からlax Z陽性細胞を単離することです。これは、細胞の生存率を維持し、十分な開始組織を確保するために、まず比較的短時間で多数のマウス蝸牛を単離することによって達成されます。第2ステップとして、LAX Z陽性細胞を解離させ、その後ラベル化することで、ソーティングに向けた組織の調製を行います。

その後、フローサイトメトリーを用いて細胞を分取します。得られたLAX Z highおよびlax lowの集団を、さらなる実験に使用することができます。この手法は、内耳における遺伝子プロファイルや特定の細胞集団は何かといった、耳研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。

本手順の実演は、当研究室の医学生であるTaha Gen Aが行います。まず、35 mmのペトリ皿にHBSSを満たし、氷上に置きます。次に、安楽死させた生後0〜3日のaxon-2 laxyレポーターマウスおよび野生型マウス12〜15匹を、アイリス剪刀を用いて斬首します。

頭部を氷上の60 millimeterペトリ皿に置きます。次に、Dumont 5番ピンセットとアイリス剪刀を用いて、頭部から下顎骨と舌を切り出し、口蓋の高さで頭蓋底を切断します。続いて、頭蓋頂部の皮膚を除去し、大後頭孔の下側から口蓋の中央に向かって剪刀を挿入し、頭蓋底を横断的に切断します。

ハサミを用いて、口蓋の切開端から両側のcalverの上端に向かって、もう一度切開を加えます。この際、耳包に損傷を与えないよう注意してください。次に、フレームの上端と大後頭孔から始まり、硬口蓋の冠状切開まで至る45度の角度の切開を2箇所行い、側頭骨の分離を完了させます。

次に、分離した側頭骨をHBSSを入れた35mmペトリ皿に入れ、氷の上に置き、その氷を滅菌済みの解剖用フードへ移動させます。続いて、別の35mmペトリ皿にPBSを満たし、氷の上に置きます。55番ピンセットを2本使用します。

まず、耳胞を覆っている側頭骨から、皮質、脳幹、および小脳を慎重に除去してマイクロダイセクションを開始します。次に、耳胞を除去せずに、前庭蝸牛神経の入口から耳胞内部に向かって、蝸牛被膜の一部を削り取ります。蝸牛底を露出させた後、コルチ器と周囲の組織を慎重に引き出します。

次に、基底側から始めて、残っているらせん神経節と血管線条を除去し、蝸牛をPBSを満たしたペトリ皿に移します。まず、コーティングされていない6ウェル培養プレートの1〜2つのウェルの中心に、滅菌PBSを50 µLずつピペットで分注します。その後、各PBS液滴に蝸牛を最大20個まで移します。

次に、0.125% trypsin 50 µL分注液を37 °Cのウォーターバスで約2分間予熱します。その後、ディッシュを揺らさないように注意しながら、trypsinを蝸牛に添加します。

蝸牛を37°Cで8分間インキュベートします。各ドロップに50µLの大豆トリプシンインヒビターを加えてトリプシン処理を停止させ、次にP200ピペットマンを125µLに設定し、さらに50µLの完全培地を加えます。300µLのブライトチップを用いて、気泡が入らないように注意しながら、細胞を穏やかに80回ピペッティングします。

各ドロップレットのトリチュレーション後、さらに200 µLの完全培地をそれぞれに加えます。次に、細胞を40 µmのセルストレーナーに通して、同じ6ウェルプレート内の新しいウェルに移します。その後、各ウェルの細胞を個別の標準的なFACSTubeに転送します。

次に、3本のチューブそれぞれに野生型細胞を100 µL加え、続いてCUGのみを300 µLの完全培地で希釈します。コントロールとして、axon、2つのLAX Z細胞 10 µLを390 µLの完全培地で希釈します。残りのaxonおよび2つのLAX Z細胞を、400 µLのOTsを含むfaxチューブに移します。

その後、チューブを37 °Cの加湿インキュベーターで10分間インキュベートし、各適切なfaxチューブに200 µLの希釈CUGを加えます。次に、すべてのチューブを遮光し、細胞を37 °Cの加湿インキュベーターで25分間インキュベートします。細胞のインキュベート中に染色準備として、新鮮に調製した10 mLのheaps＋FBSを15 mLチューブに入れ、チューブを氷上に置きます。

次に、光への曝露を最小限に抑えるため、消灯した状態で滅菌フード内にて、氷冷したheap solutionを各fax tubeに1.8 millilitersずつ加えます。続いて、室温で1200 RPM、5分間、細胞を遠心分離します。その後、上清を除去し、ペレットを300 microlitersの完全培地で再懸濁します。

ソート用サンプルのすべての分注量をプールし、次に各適切なチューブにプロピジウムヨードを加え、最終濃度を1 µg/mLにします。最後に、細胞を覆い、もう一度氷上に置きます。まず、未染色の野生型細胞のイベントを1000件収集し、前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）プロットにおける細胞分布を決定して、ソートゲートを設定します。

必要に応じて前方散乱光および側方散乱光のパラメータを調整します。次に、未染色の野生型、PI染色した野生型、およびCUG染色した軸索を用いて補正を行います。LAX Z細胞を2個使用します。

2本の FACS チューブに完全培地を 500 µL ずつ満たします。次に、野生型 PI 染色細胞と Axon 2 Lae CUG 染色細胞の解析を開始し、前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）プロットに基づいてデブリを除去するためのゲートを設定します。前方散乱光高さ（FSC-H）対前方散乱光面積（FSC-A）プロットを用いて、ダブレットや凝集塊を除外します。

次に、前方散乱光（FSC）面積対PE sci five面積プロットに基づき、PI陽性の死細胞を除外します。各ゲート設定について、前方散乱光面積対CascadeまたはPacific Blue面積のプロットを作成します。野生型細胞を用いて設定したすべてのゲートおよびプロットを使用し、axon two laxy、PI、およびCUGで染色された細胞を含むソートサンプルチューブから10,000イベントを解析します。

全イベント数の1%未満となるように、Cascade Blue高発現細胞のゲートを作成します。Cascade Blue高発現ゲートには、Axon 2 laxyサンプルの細胞の約15～20%が含まれているはずです。Axon 2 laxy細胞の解析プロットを用いてこれらAxon 2高発現細胞を特定し、前述のゲーティング戦略を用いて、蛍光強度が最も低い15～20%の細胞に対するゲートを作成します。

細胞を完全培地を含むFACSチューブに分取し、分取中は回収チューブを4 °Cに冷却したチャンバー内に保持します。フローサイトメーターでカウントされた各集団の細胞数を記録してください。左図は野生型の解離細胞、右図はaxon 2 LA Zの解離細胞における、前方散乱光（FSC）面積に対する側方散乱光（SSC）面積を示しています。

蝸牛細胞が示されています。Y軸に近いデブリ陰性集団として指定されたイベントよりもはるかにサイズの大きい、個別のイベント群のゲーティングに注目してください。通常、これら2つのパネルにおける野生型およびaxin two LAX Zの蝸牛の両方から、40～45%のデブリフリー細胞が回収されます。

前方散乱光（FSC）の高さ（height）対前方散乱光の面積（area）を用いて、以前にゲート設定したデブリからダブレットを除外します。プロットの予想される線形性から逸脱した陰性集団のイベントを除外します。この準備により、通常、ここに示す指定ゲート内に71.1%のイベントが得られます。

PE SCI 5チャンネルで検出されるプロピジウムヨード（PI）は、これらのスキャッタープロットに示されているように、死細胞を除外するために使用されます。ソートされた細胞の約95%は生存しており、これらのパネルではPIを取り込んでいませんでした。右図に見られるように、Cascade blueチャンネルは蛍光基質CUGの検出に使用されました。

平均して、CUG陽性細胞の上位約20%がlae high細胞であり、これは動物10〜12匹あたり約15,000個のaxon、2個のhigh細胞に相当します。このビデオを視聴することで、細胞ソーティング実験および遺伝子プロファイリングなどの実験の両方に向けて、流式細胞分析を用いて内耳組織からlaxy high細胞を調製および分離する方法について十分に理解できるはずです。