2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

本手順の全体的な目的は、2D培養および3D ex vivoモデルにおける神経前駆細胞の遊走に対する印加電場の影響を記録することです。これは、まずin vitroで神経前駆細胞を単離および増殖させることで達成されます。次のステップは、神経前駆細胞の単一細胞懸濁液を調製することです。

次に、2D培養の準備として、神経前駆細胞をカスタム設計の電場チャンバーに播種します。あるいは、3D ex vivoモデルの準備として、神経前駆細胞をhooks 3, 3, 3, 4, 2で標識し、脊髄切片オルガノタイプモデルに注入します。最終的に、電場チャンバーに電場を印加し、タイムラプス recordingを行うことで、2Dおよび3Dの両環境において前駆細胞が電場の陰極に向かって遊走することを示します。

この手法の主な利点は、天然の環境に酷似した3D器官模倣モデルへの移植後における、個々の細胞の電界誘導移行をライブトラッキングするための新しい方法を提供することです。この方法は、脊髄切片に移植された神経幹細胞の移行に関する電気的手法の知見を提供できるだけでなく、脳切片モデルなどの他の小規模なシステムにも適用可能です。この手順を開始するには、オートクレーブ済みの22 by 22 millimeterのガラスを分割して、22 by 11 millimeterのストリップを準備します。

ダイヤモンドペンを使用して、No.1厚さのカバーガラスを半分に切断します。次に、22 × 11 mmのガラスストリップ4枚を、高真空シリコングリスを用いて垂直に接着し、内寸22 × 10 mmの自立型ガラスウェルを作成します。ウェルをそのまま一晩放置し、完全に乾燥・硬化させてください。翌日、2枚の22 × 11 mmガラスストリップを、10 mmの間隔を空けて平行に配置し、シリコングリスを用いて100 mm培養ディッシュの底面に固定します。

次に、シリコングリースを用いて22 by 22 millimeterのカバーガラスを貼り付け、これらのストリップ間の領域を密閉します。カバーガラスの上にガラスウェルを配置し、内壁で細胞を播種するための限定された空間を作成します。すべての接合部をシリコングリースで防水処理します。

付随する論文に記載されている通り、この限定領域をポリリシンでコーティングした後、続いてラミニンでコーティングします。この手順では、E 14からE 16のマウスから脳を取り出し、冷やしたD-M-E-M-F 12基礎培地に置きます。次に、解剖顕微鏡下で髄膜を除去します。

その後、脳を35 mmのペトリ皿に移します。微細ピンセットを用いて、脳を組織片に分散させます。次に、それらを15 mL遠心チューブに移します。

サンプルを800 RPMで3分間遠心分離し、Dのデブリを除去します。次に、BFDFおよびDGFを含むA-D-M-E-M-F 12をサンプルに加えます。1 mLピペットを用いて、それらをトリチュレーション（混和）します。

次に、セルストレーナーを用いて単一細胞懸濁液を得ます。細胞を1mLあたり20,000〜50,000個の密度でフラスコに播種します。その後、3日ごとに全量培地交換を行い、その際、細胞を1,300 RPMで5分間遠心分離します。

上清を廃棄し、PTを新鮮な培地に懸濁させ、少なくとも5回、6日ごとに細胞をフラスコに戻します。NEUROSPHERESを15 mLチューブに移し、1,500 RPMで5分間遠心分離します。上清を廃棄してください。

ペレットをtrypsin-EDTAで再懸濁し、単一細胞懸濁液を作成します。細胞数を測定する前に、10,000個の細胞を含む懸濁液を1 mL調製します。次に、ガラスウェルからラミニンを除去し、完全に乾燥させます。

それを1 mLの細胞懸濁液に置換します。その後、細胞を接着させるため、ディッシュを37 °Cのインキュベーターに最低4時間置きます。細胞が十分にコンフルエントになったら、チャンバーから培地を除去します。

ガラスを慎重に取り除きます。次に、シリコングリースを用いて、22×11 mmのストリップ2枚の間にオートクレーブ滅菌済みの22×22 mmガラスカバースリップを慎重に取り付け、細胞の上に屋根状の構造を形成します。乾燥を防ぐため、細胞に培地を数滴垂らして覆うことを忘れないでください。

次に、ディッシュの一端から他端まで2つの水密性のシリコングリスバリアを作成し、チャンバーの両端に独立した培地リザーバーを形成します。チャンバーに新鮮な培地を満たし、一方の培地リザーバーからもう一方へ流れがあることを確認します。その後、細胞を回復させるため、ディッシュをインキュベーターに戻し、12時間静置します。

次のステップでは、移行チャンバーの各リザーバーの上に1つずつ、計2つの穴を開けてディッシュを覆うための蓋を準備します。次に、チャンバー内の培地を25 millimeter hippies bufferを含む培養培地に交換します。その後、ディッシュを温度制御イメージングシステムに転送します。

タイムラプスおよびマルチポジション記録の実験パラメータを設定します。顕微鏡での観察時およびイメージングシステムでの記録時に電界ベクトルが水平方向になるよう、カソードが左側、アノードが右側にくるようにチャンバーを配置します。次に、ビーカー2個に溶液を満たします。

Steinberg溶液を用いて。あらかじめ2% Steinbergアガロース溶液で満たしたガラスブリッジを使用し、各培地リザーバーに個別のビーカーを接続します。次に、直流電源に接続された銀電極をSteinberg溶液の中に配置します。

各ビーカーにおいて、電源の電圧ダイヤルをゼロに設定し、スイッチを入れます。電圧ダイヤルを回しながら、電圧計で電極室の両端の電圧を測定します。その後、実験要件に合わせて電圧を調整してください。

その後、タイムラプス撮影を開始します。培地交換を行い、必要に応じて電圧を再調整してください。1時間ごとに、必要に応じて新鮮な培地、薬剤、または化学剤をリザーバーに追加してください。

培地リザーバーのそれぞれの上に配置されるよう、培養皿の蓋に追加の穴を開けて使用します。このステップでは、生後2週齢のマウスの腰髄を摘出します。次に、解剖顕微鏡下でMachel-Wane組織チョッパーを用い、脊髄を500 micron厚の切片にスライスします。

スライスを分離し、矢状面の軸方向の脊髄構造が維持されているものを選択します。次に、30 µLのMAゲルを入れた100 mmペトリ皿にスライスを配置します。できるだけ中心に近い位置に配置してください。

それらを5%二酸化炭素インキュベーターにて37°Cで少なくとも30分間保持します。Matrigelタンパク質が自己集合して脊髄スライス表面を覆う薄膜を形成するためには、Matrigelが完全に集合していることが非常に重要です。必要に応じてシャーレを37°Cでさらに30分間インキュベートし、その後、25 mM HEPESバッファーおよび15～20%胎児牛血清を含むDMEM/F12培地を4～6 mL添加します。

培地がスライスに直接流れるのを避けるため、非常に慎重に、スライスが培地に完全に浸からないようにし、ナスの表面が十分に空気に触れる状態にします。培地は週に2回交換してください。次に、神経前駆細胞懸濁液を5 µMのhooksを含む培地中でインキュベートします。

30分間、3, 3, 3, 4, 2で保持します。顕微鏡下で、キャピラリーガラス管を用いて、懸濁液2 µLを脊髄スライスにマイクロインジェクションします。キャピラリーガラス管がMatrigelを通過し、脊髄スライスの内部に到達していることを慎重に確認してください。

細胞の懸濁を防ぐため、ガラス管を脊髄スライス内に少なくとも 30 seconds 間保持します。その後、脊髄スライスを入れた Petri dish を 37 °C、5 % CO2 のインキュベーターに入れ、一晩培養します。翌日、脊髄スライスの周囲に電場形成チャンバーを構築し、500 mV/mm の電場を印加する前に、ラベル付けされた neurogenesis cells 3 3 3 4 2 フックを配置します。

ここでは、電界にさらされた際に神経前駆細胞が陰極に向かって高度に指向性のある移動を示す様子が示されています。赤線は細胞移動の軌跡を、青い矢印は移動方向をそれぞれ表しています。また、こちらに移動経路のプロットを示します。ここでは、フック 3 3、3、4 2 でラベル付けされた神経前駆細胞を示しています。

これらを、電場処理の開始時点で、器官培養脊髄スライスに移植しました。神経前駆細胞が陰極に向かって2.5時間方向性遊走した後、電場の極性を反転させました。電場の極性を変更することで、新しい陰極に向かって軸索の急激な方向転換が引き起こされました。

脊髄スライス内に移植された神経前駆細胞の画像がこちらです。タイムラプス記録の終了時における、脊髄スライス内での移植神経前駆細胞の3D再構成図がここに示されています。Mass mastered。

適切に開発された後であれば、この手法は2週間で完了させることができます。本手法により、細胞生物学分野の研究者が、電場への応答に対する2Dおよび3D培養システムにおける神経前駆細胞の遊走を探索し、応用することが可能になります。