内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

この手順の全体的な目的は、マウスの皮質における微小領域の組織低酸素状態をin vivoで直接的に可視化することです。まず、麻酔下にあるマウスに開頭 cranial window を作製します。次に、大脳血管を標識するために蛍光色素を静脈内投与します。

最後に、固有のNADH蛍光と蛍光標識された皮質微小血管の光子イメージングを同時に行います。これにより、最終的に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型の存在を可視化することで、脳実質の微小領域における機能的低酸素状態を示す結果を得ることができます。クラーク型電極などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、広い視野において高い空間分解能が得られ、かつ低侵襲であることです。

この手法は、2つの蛍光チャンネルを備えた標準的な2光子システムで実施可能です。こんにちは、ロチェスター大学の微生物学・免疫学教授兼学部長のスティーブ・ハーストです。本日の手順を実演するのは、Kishka研究室のAnita's sonと、私の研究室のリサーチアシスタント教授であるOxana Paulkaです。NADHイメージング技術を切り拓いたDr.Kishkaは、最近ドイツへ転勤したため、本日は出席できません。オートクレーブ滅菌または70% ethanolで消毒した必要な器具を用いて手術部位を準備し、マウスを5% isof fluorineで麻酔した後、ヒーティングパッドの上に配置し、フェイスマスクを装着して1.3から1.5% isof fluorineを空気中で投与します。

尾部のピンチテストを行い、麻酔深度を確認します。次に、直腸プローブを挿入し、処置の間、動物の体温を継続的に測定します。マウスの目が乾燥するのを防ぐため、人工涙液ジェルを塗布します。

次に、頭部と両太ももの脱毛を行います。太ももには除毛剤を2分間塗布して残った毛を除去します。この太ももをオキシメトリに使用します。最後に、10%ポビドンヨード溶液と70%エタノールを用いて頭皮を消毒します。頭蓋窓を作成するため、頭蓋骨から5 mmの位置でハサミを用いて切開します。

頭皮を切開し、1cm進めます。皮膚を側方に寄せ、頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨上の膜を除去します。10%塩化第二鉄溶液を塗布します。

余分な溶液を拭き取り、45度の角度で膜をこそげ落とします。5番、ピンセットを用い、解剖顕微鏡を使用して目的の領域を特定します。ヘッドプレートのウィンドウの縁に沿って、速乾性接着剤を薄く塗布します。

ヘッドプレートを、関心領域がウィンドウ内に露出するように配置し、プレートに軽く圧力をかけます。少量の歯科用セメントを塗布し、迅速に重合させます。接着剤が重合する間、10秒間保持します。

速乾性接着剤をウィンドウの端に少量塗布し、ヘッドプレートと頭蓋骨を密封します。次に、解剖顕微鏡下で、ヘッドプレートをアニマルホルダーにネジで固定します。その際、6,000 RPMに設定したmicro torque twoドリルセットとIRF 0 0 5ドリルビットを使用してください。

頭蓋骨およびヘッドプレートから余分な接着剤をすべて取り除きます。次に、ドリルの回転数を1000 RPMに設定し、ヘッドプレートのウィンドウ内で直径約5 mmの円を描くように頭蓋骨を穿孔し始めます。非常に柔らかい鉛筆で描くように、軽く掃くような動作で行ってください。

20～30秒ごとにドリリングを停止し、圧縮空気を用いて骨粉を除去します。ドリリングが進むにつれて、中央の無傷の頭蓋骨の周囲に溝が形成されます。薄い頭蓋骨を突き破らないよう注意し、この溝の厚さが均一になるようにしてください。

さらに、太い血管の周辺では十分に注意してください。血管を損傷させてはいけません。また、可能であれば接触さえ避けてください。ピンセットの片方の先端で、ウィンドウ中央の骨を持ち上げ、ウィンドウ上に人工脳脊髄液を1滴滴下します。キムワイプの角を使い、45度の角度で人工脳脊髄液を静かに拭き取ります。

5番目、ピンセットです。窓の縁に沿って硬膜の損傷部位を特定し、それを持ち上げて除去します。出血が生じた場合は、人工髄液を1滴滴下し、軽微な出血が止まるまで2〜3分待ちます。

次に、人工脳脊髄液に溶解させた0.07%低融点アガロースを10 mL準備します。融解したアガロースを体温まで温めます。脳表面から余分な人工脳脊髄液を拭き取ります。

エアロをウィンドウに注ぎ、ガラススライドで覆います。次に、ガラスを軽く押し当ててヘッドプレートに密着させ、エアロが凝固するまで10〜20秒間待ちます。ピンセットと柔らかいティッシュペーパーを使用して、ガラスカバー上の余分なエアロを取り除きます。

少量の速乾性接着剤をガラスの周囲に塗布し、ヘッドプレートに固定します。次に、大腿静脈への注入を確実にするため、少量の歯科用セメントを塗布して接着剤を固定します。動物を部分的に反転させ、左大腿部の内側を露出させます。

テープを使用して動物を固定します。この状態で、皮膚に消毒用スクラブを塗布し、続いて100%エタノールを塗布します。次に、膝から恥骨結合に向かって大腿内側に沿って切開します。

必要に応じて、鈍的剥離によって軟組織を分離します。1 mL シリンジに 130 µL の Texas red を充填します。新しい 30G 針を取り付け、面取りを上に向けたまま、慎重に 30 度の角度に曲げます。

解剖顕微鏡下でニードルにTexas Red溶液を満たし、ニードルを大腿静脈に挿入して100 µLのTexas Redを注入します。ニードルを抜き、ガーゼで静脈を軽く圧迫して止血します。血中酸素飽和度を継続的にモニタリングするため、4-0縫合糸を用いて皮膚を閉鎖します。

あらかじめ除毛しておいた右大腿部にオキシメータープローブを装着します。イメージングを開始するため、外科的に処置したマウスを顕微鏡ステージに移します。高倍率でのフォトニクス解析時のレジストレーション用リファレンスマップとして使用するため、明視野照明下、4倍の倍率で頭蓋窓部位の初期画像を撮影します。

10倍の倍率で関心領域を拡大します。皮質層の中に関心領域を選択してください。タイムシリーズの記録を開始するために、1または2を選択します。

画質を向上させるため、平均3〜5フレームを使用することを推奨します。次に、動物が呼吸している空気に50%の窒素を添加し、低酸素血症を誘発します。これにより、酸素レベルは10%になります。オキシメーターのデータをモニタリングして、低酸素血症を確認してください。

低酸素血症の間および正常な酸素レベルに回復した後、約30秒間、タイムシリーズの記録を継続します。血管周囲の低酸素領域および酸素化された組織シリンダーの領域を検出し、測定および定量化することで、酸素分布の算出に必要なデータを収集します。組織シリンダーの半径Rを決定するために、血管の中心から高いNADH蛍光が検出される境界までの距離を測定します。

データ処理方法については、記述プロトコルを参照してください。この図は、一過性低酸素血症のビデオ記録時に得られたNADHおよび地理学的画像を同時に示したものです。吸入酸素濃度を21%から10%に下げ、3分間維持しました。このレベルの実験的に誘発された低酸素血症は、大脳皮質に重度の低酸素状態を誘発するのに十分な濃度です。

低酸素状態により、最初は動脈血供給から最も遠い領域で、緑色に示されるNADH蛍光の増加が認められました。赤色で示される皮質微小循環からの酸素拡散の観察可能な組織境界を表す、急峻なNADH組織境界に注目してください。ここでは、赤色で標識された皮質の微小血管と、緑色で示される皮質灰白質からの内在性NADH蛍光の同時画像を示しており、NADH蛍光強度の分布はバイナリ（二値的）です。

NADH蛍光が均一に低い領域と、均一に高い領域が存在します。黄色の線は、NADH蛍光の低強度領域と高強度領域の間の組織境界を表しています。これらの組織境界は、近接する微小血管との空間的な関係性を示しています。

この関係は、微小血管から組織への酸素拡散によって決定されます。場合によっては、これらの組織境界の円筒状の特性またはCRO組織シリンダーを、青色の線で示されるように直接認識することが可能です。ここでは、組織境界は円形であり、中心に同心円状の血管が存在します。

適切に実施すれば、この手法は1.5時間で完了します。この手順を行う際は、浮腫による皮質表面の垂直方向の移動を防ぐため、カバーガラスを金属プレートに接着することを忘れないでください。本手順の後、組織低酸素症と脳血管カップリングの関係など、さらなる疑問を検討することを目的とした機能性充血の測定などの追加分析を行うことができます。

このビデオを視聴することで、マウス皮質における微小領域の組織低酸素状態を視覚化する方法について十分に理解できるはずです。