HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

この手順の全体的な目標は、HIV ビロトキシン tat に長時間さらされた後の皮質毛細血管ネットワークの変化を定量化することです。この方法は、HIV関連の神経認知障害の病因に寄与する可能性のある皮質毛細血管形態の主要な変化を調べるのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数の毛細血管形態学的パラメータを生理学的に正確に定量化できることです。

しかし、この方法はHIV関連の神経認知障害の病因についての洞察を提供することができます。また、アルツハイマー病など、血管の変化が起こる他の疾患にも適用できます。この手順は、麻酔をかけたマウスの目に人工涙液ジェルを塗布することから始めます。

次に、電気カミソリを使って頭を剃ります。その後、ポビドンヨウ素溶液を塗布して頭皮を滅菌し、乾燥させます。光学顕微鏡下で、動物の頭皮を取り出して、頭頂骨、尾側前頭骨、およびブレグマポイントを完全に露出させます。

10%塩化第二鉄溶液を少量頭蓋骨に塗布し、膜を乾燥させて簡単に除去します。その後、鉗子で頭蓋骨をそっとこすり落とすことにより、乾燥した膜を取り除きます。次に、ヘッドプレートの窓の周りに接着剤の薄い層を塗ります。

ヘッドプレートをマウスの頭蓋骨にそっと押し付けて、関心領域をウィンドウの中央に保ちます。その後、ヘッドプレートに歯科用セメントを一滴垂らして、接着剤を重合させます。次に、ヘッドプレートウィンドウの端に沿って接着剤の薄い層を塗布して、生理食塩水を保持するためのリザーバーを作成します。

接着剤が乾いたら、ヘッドプレートをマウスヘッドプレートハーネスにねじ込みます。マイクロトルプドリルに取り付けられたドリルビットを使用して、ヘッドプレートウィンドウから接着剤を取り除きます(6, 000 rpmに設定)。マウスの頭蓋骨の過熱を防ぐために、10〜15秒ごとに停止します。

その後、新しいドリルビットを使用して、4, 000 rpmのマイクロトルプドリルセットを使用して頭蓋骨を薄くし始めます。ドリルを直接下向きに圧力をかけずに、頭蓋骨を横切ってゆっくりと動かします。頭蓋骨が完全に薄くなったら、マウスをホルダーから取り外して背中に置きます。

両後肢をそっとテープで留めて、太ももの内側をはっきりと露出させます。次に、両方の内側の太ももの上の毛を取り除き、太ももをポビドンヨードで覆って手術部位を消毒します。次に、大腿静脈と動脈の上にある右大腿内側の皮膚をやさしく取り除きます。

手術部位に0.9%生理食塩水を約3〜5滴塗布します。次に、大腿神経血管束に鈍く解剖することにより、大腿静脈を動脈から分離します。次に、大腿動脈の下に約1センチ間隔で、3センチメートルの外科用縫合糸を2つ配置します。

上部縫合糸を時計回りにひねると、カテーテル挿入中の過度の失血を防ぐのに役立つ血管止血帯が作成されます。その後、スプリングハサミを使用して大腿動脈に小さな切開を行い、後でカテーテルを挿入してマウスの生理学的パラメータを監視します。この手順では、マウスの左大腿部の内側の皮膚を切除します。

次に、大腿静脈を見つけます。1ミリリットルの注射器と30ゲージの針を使用して、130マイクロリットルの蛍光色素溶液を吸い上げます。100マイクロリットルの染料をゆっくりと大腿静脈に注入します。

針を抜いた後、注射部位に安定した穏やかな圧力をかけて出血を止め、染料を5分間循環させます。次に、縫合糸で手術部位を閉じます。マウスを慎重に胃の上に戻し、マウスヘッドプレートハーネスに入れます。

in vivo 2光子イメージングの場合は、手術装置を2光子顕微鏡に移し、動物の麻酔レベルを維持してください。次に、0.9%生理食塩水を少量のヘッドプレートリザーバーに入れ、顕微鏡の対物レンズを下げて生理食塩水に接触させます。次に、明視野表示対物レンズを使用して対象領域を特定します。

その後、2光子イメージングを開始します。ビュースクリーン上に毛細血管ベッドを配置し、光学ズームを使用してこの領域も拡大します。2光子イメージングソフトウェアを使用して毛細血管の画像を取得します。

ex vivo 2光子イメージングでは、頭皮を頭頂間骨から切断されたマウスの前頭骨まで切開します。人差し指と親指で皮膚を頭蓋骨の側面に固定し、極細のハサミを内側頭頂間骨の下に置き、矢状縫合糸に沿って頭蓋骨をブレグマ点から約3mm後まで切断します。次に、頭蓋骨を脳から分離し、鉗子で脳の表面から髄膜を慎重に取り除きます。

鉗子を脳の下にそっとスライドさせて、頭蓋骨から鉗子を解放します。その後、脳をマウス専用の脳マトリックスに入れ、ACSFの滴で洗います。次に、ミリメートルの厚さの冠状脳切片を切除します。

脳の切片をACSFが入った凹面のスライドガラスの上に置き、切片の最も前方の部分が上を向くようにします。次に、脳のスライスをガラスカバースリップでそっと覆います。スライドを顕微鏡ステージに移し、カバースリップに0.9%生理食塩水を少量入れます。

顕微鏡の対物レンズが生理食塩水に接触するまで下げます。次に、明視野対物レンズを使用して脳の正中線を特定します。次に、2光子イメージングを開始し、25倍対物レンズを使用して正中線を再度特定します。

これを達成するには、冠状切片の皮質表面にある縦方向の裂傷を探します。次に、イメージング画面の右端を正中線に置き、ビューア画面を3つの完全なフレーム上で横方向に移動します。ビュー画面で毛細血管がほとんど見えない深さを見つけます。

次に、焦点面をさらに 20 マイクロメートル下げて、Z スタックの上部を決定します。画像の厚さを1マイクロメートルに設定します。ビュー画面を 100 マイクロメートル下げ、ピクセルの 1% 未満が過飽和になるように、レーザー出力を全体的に調整します。

最後に、zスタックを取得します。この図では、脳切片を作製した後、正中線から約1.5mmのところに撮像領域が位置しています。100マイクロメートルのzスタックは、Amira Analytical Softwareでの分析に使用される3次元画像を生成します。

次に、キャピラリーネットワークの始点と終点、または1つのキャピラリーが別のキャピラリーに分岐する任意の場所にノードを配置することにより、キャピラリーネットワークを手動でトレースします。これにより、完全にスケルトン化された画像が生成され、そこからモルフォロジー パラメーターが自動的に抽出されます。毛細血管リンパ節の数、セグメント、平均セグメント長、および全体のセグメント長は、マウス脳スライスの2光子ex vivoイメージングを用いて抽出することができる。

ここでは、in vivoイメージングにより毛細血管網の2次元画像を作成し、ex vivoイメージングから得られた毛細管径と総セグメント長を用いて毛細管径を抽出し、毛細血管の総体積を計算することができます。この手順をマスターすると、適切に実行すれば3時間半で完了できます。この手順を実行するときは、イソフルランが皮質毛細血管の血管拡張を引き起こし、データを歪める可能性があるため、安定した麻酔レベルを維持しながら迅速に行動することが重要です。

この手順では、赤血球の速度や赤血球フラックスなどの他の毛細血管パラメータを取得できるため、HIV関連の神経認知障害やその他の神経変性疾患に見られる病原性変化をより深く理解することができます。あなたの実験に頑張ってください。